复合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治疗中的应用

萧雅一 ，杨莉，牟雁东

(1.南充市中心医院口腔科，四川 南充　637000；2.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都　610041；3.四川省人民医院口腔科，四川 成都　610000)



复合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治疗中的应用

萧雅一1，杨莉2，牟雁东3

(1.南充市中心医院口腔科，四川 南充637000；2.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都610041；3.四川省人民医院口腔科，四川 成都610000)

目的：观察复合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治疗中的协同抑菌效果和临床疗效分析。方法：研究分为两部分，第一部分为体外抑菌实验，选择智牙冠周炎内常见的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形链球菌，以等二倍梯度稀释法稀释的人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)液和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)DP7液，加入96孔细胞培养平板，经37.0 ℃恒温培养箱内培养24 h后，测试hLYZ、AMPs DP7有无协同抑菌作用。第二部分为临床实验，随机将智牙冠周炎患者分为实验组和对照组，每组各69例，实验组使用复合多肽溶菌酶漱口水，对照组使用口泰含漱液。连续3 d复诊，分别在治疗前、治疗后第 1天和治疗后第2天对患者冠周分泌物进行菌落计数和临床指标评价。结果：AMPs DP7和hLYZ联合使用后，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的标准株和部分耐药株，变形链球菌的标准株产生协同抑菌作用。协同系数FIC=0.5。临床结果表明，使用复合多肽溶菌酶漱口水后，冠周菌落计数明显低于对照组(Z=-2.109，P=0.035)，差异具有统计学意义；对两组间局部疼痛明显好转和张口度明显增大的比较(χ2=5.412，P=0.032)，差异具有统计学意义。结论：AMPs DP7和hLYZ联合应用对引起智牙冠周炎的部分细菌具有良好的协同抑菌效果，复配后加入漱口水局部使用能有效减少盲袋和冠周内细菌繁殖、缓解智牙冠周炎的症状。

复合多肽溶菌酶；智牙冠周炎；协同抑菌；临床疗效

【Abstract】Objective：To observe the synergistic antibacterial effect of composite polypeptide lysozyme in treating opsigenes pericoronitis and evaluate its clinical effect.Methods：This experiment was composed of two parts;the first part is in vitro bacteriostasis experiment,selecting the sensitive bacterium in opsigenes pericoronitis,including staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa,streptococcus mutan.Added the dilution of antibacterial peptides and human lysozyme by two times the gradient dilution method into 96 cell culture plate;after 24 hours culture in 37.0 ℃ constant temperature incubator,observed whether antibacterial peptides compound human lysozyme have synergistic antimicrobial effect or not.The second part is clinical experiment.Randomly divided patients into experimental group and control group,69 cases in each,the experimental group used compound lysozyme polypeptide mouthwash;the control group used compound chlorhexidine gargle.After three consecutive days of follow-up,which is before treatment,the first and second day after treatment,counted the colony of periodontal secretions and evaluated clinical indicators.Results：The combined use of antibacterial peptides and human lysozyme have synergistic antimicrobial effects to standard strains of staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa,streptococcus mutans,and parts of resistant strains of staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa.Conclusion：Antimicrobial peptides complex human lysozyme has good synergistic effect on some bacteria caused opsigenes pericoronitis,compounded as gargle water can effectively reduce the blind pouch bacterial reproduction,alleviate the symptoms of opsigenes pericoronitis.

智牙冠周炎是临床上常见的口腔颌面部感染性疾病之一，常发生于18～30岁的青壮年[1]。智牙冠周炎早期局部治疗，能有效阻止其向全身感染发展。目前临床上常见的局部治疗药物主要以广谱抗菌素为主，随着耐药菌株的出现和增多，新型的抗菌制剂逐渐受到青睐。本研究通过对人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)和DP7型抗微生物肽简称抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)的联合应用，观察其对智牙冠周炎敏感细菌的协同抑制作用和临床疗效。

1　材料与方法

1.1体外抑菌实验

选择对智牙冠周炎敏感的金黄色葡萄球菌6株,其中标准株1株(编号25923)，耐药株5株(编号S2、S4、S5、S7、S8)；大肠杆菌9株,其中标准株1株(编号25922)，耐药株8株(编号E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8)；绿脓杆菌3株，其中标准株1株(编号27853)，耐药株2株(编号Pear1、Pear2)；变形链球菌标准株1株(编号25175)。分别配制菌液后经酶标仪在595 nm处测得OD值，根据OD值稀释菌液，使其浓度为5×108CFU/L，此浓度即为实验需要的菌液浓度。

配制母液浓度为5 000 mg/L的hLYZ液和256 mg/L的AMPs液，并以等二倍法分别稀释hLYZ液和AMPs液，见表1。

表1　hLYZ液和DP7液浓度(mg/L)

细菌培养：使用96孔平板，第一排分别加入浓度为128 mg/L 、64 mg/L、32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L的DP7液 100 μL作为DP7液对照组，第八排分别加入浓度为2 500 mg/L、1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L、156.25 mg/L 、78.125 mg/L的hLYZ液100 μL作为hLYZ液对照组，再分别加入培养好的实验菌液100 μL；中间的棋盘格(6×6)分别在横排加入50 μL的DP7液，浓度依次为64 mg/L、32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L；竖排加入50 μL的hLYZ液，浓度依次为1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L、156.25 mg/L、78.125 mg/L、39.062 5mg/L；再分别加入培养好的实验菌液100 μL作为联合用药实验组。在37.0 ℃恒温培养箱内培养24 h后，经酶标仪检测，测试hLYZ、DP7有无协同抑菌作用。

1.2临床实验

1.2.1研究对象选择在南充市中心医院口腔科诊断为智牙冠周炎的患者138例做为研究对象，其中男性63例，女性75例，年龄19～45岁，平均年龄25.32岁。采用随机、双盲、平行对照设计方案，随机分为实验组和对照组，每组各69例。纳入标准：(1)下颌第三磨牙阻生，智牙冠周炎急性发作，冠周牙龈红肿，冠周、盲袋内有食物残渣及分泌物；(2)临床症状有局部疼痛、张口度减小、进食不方便者，个别患者有颌下淋巴结肿大；(3)无发热，无全身感染症状者；(4)近期未使用抗菌素者。排除标准：(1)口腔卫生习惯较差，自身维护不力者；(2)妊娠期及哺乳期妇女；(3)患有内分泌系统疾病、免疫系统疾病、循环系统疾病、代谢疾病、血液疾病、营养不良等。

1.2.2冠周、盲袋内取样冠周冲洗前，用微量移液器取冠周、盲袋内分泌物1 μL，经生理盐水稀释1 000倍，震荡器震荡30 s，均匀分散细菌团块后取1 μL样本。

1.2.3细菌培养在生物安全柜内，取1 μL样本接种于哥伦比亚血琼脂培养基，在隔水培养箱内，35.7 ℃培养48 h后进行菌落计数，采用细菌菌落形成单位计数，单位CFU/mL。

1.2.4椅旁冲洗治疗在椅旁对患者行漱口水15～20 mL冲洗冠周、盲袋，冲出食物残渣、分泌物，直到冲出液清亮。嘱患者回家后用该漱口水自行含漱，每次10 mL，在口内含漱3～5 min，每天4次。漱口后30 min内不进食、不饮水。同时指导患者维护口腔卫生，宣教防护常识。

1.2.5临床症状评判(1)患者疼痛分级：根据患者主诉，采用疼痛分级法记录其疼痛程度，并用数字0～3记录：0级：无疼痛，记为“0”。I级：疼痛，可以忍受。生活正常，睡眠无干扰，记为“1”。II级：疼痛明显，不可忍受，要求口服镇痛药物，睡眠受干扰，记为“2”。III级：疼痛剧烈，不可忍受，需服用镇痛药物，睡眠严重受干扰，可伴有自主神经紊乱或被动体位，记为“3”。(2)患者开口度：根据患者开口度，记录初诊和复诊情况，以数字表示，0：开口度>3 cm。1：开口度2～3 cm。2：开口度1～2 cm。3：开口度<1 cm。4：完全不能开口。

1.2.6复诊治疗后第 1天和治疗后第2天复诊，重复前次操作。

1.3统计学分析

菌落计数采用秩和检验，比较治疗后第2天抑菌有效率。临床症状改善情况采用卡方检验，比较缓解程度。P<0.05，表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1体外抑菌实验结果分析

分别测试DP7液对照组、hLYZ液对照组、联合用药实验组的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，实验数据表明，DP7型抗菌肽与人溶菌酶联合时，当DP7浓度为64 mg/L ，hLYZ浓度为312.5 mg/L 时，对25 923的抑菌率为98.34%，对25 922的抑菌率为97.98%，对E1的抑菌率为99.51%；当DP7浓度为32 mg/L ，hLYZ浓度为156.25 mg/L 时，对S5的抑菌率为88.82%，对S8的抑菌率为100.00%；当DP7浓度为16 mg/L ，hLYZ浓度为39.062 5 mg/L 时，对E2的抑菌率为98.67%；当DP7浓度为32 mg/L ，hLYZ浓度为1 250 mg/L 时，对E7的抑菌率为90.30%；当DP7浓度为32 mg/L ，hLYZ浓度为625 mg/L 时，对27 853的抑菌率为80.92%；当DP7浓度为16 mg/L，hLYZ浓度为625 mg/L 时，对P1的抑菌率为96.64%；当DP7浓度为64 mg/L ，hLYZ浓度为1 250 mg/L 时，对P2的抑菌率为93.89%；当DP7浓度为32 mg/L ，hLYZ浓度为39.062 5 mg/L 时，对25 175的抑菌率为100.00%，具有协同抑菌意义，FIC指数=0.5；DP7液对照组中相应的MIC浓度均是联合用药组中DP7液浓度的 2倍；本组实验中hLYZ对照组的结果均为阴性，未表现出抑菌效果，见表2。对S2、S4、S7、E3、E4、E5、E6、E8没有协同抑菌作用。

表2DP7液对照组、hLYZ液对照组、联合用药实验组的MIC(mg/L)

菌种DP7对照组hLYZ对照组联合用药实验组DP7hLYZ25923128阴性结果64312.5S564阴性结果32156.25S864阴性结果32156.2525922128阴性结果64312.5E1128阴性结果64312.5E232阴性结果1639.0625E764阴性结果3212502785364阴性结果32625P132阴性结果16625P2128阴性结果6412502517564阴性结果3239.0625

2.2临床实验结果分析

2.2.1菌落计数在35.7 ℃下隔水培养箱内培养48 h后，治疗前总菌落计数实验组为15 464 CFU/mL，对照组为17 580 CFU/mL，数据不是正态分布，两个独立样本做秩和检验，n=69，Z=-0.556，P=0.578，差异无统计学意义。治疗后第 2天总菌落计数实验组为3 337 CFU/mL，对照组为4 016 CFU/mL，秩和检验抑菌有效率：n=69，Z=-2.109，P=0.035，差异具有统计学意义。

2.2.2临床症状评判(1)疼痛程度：将治疗后第 2天与治疗前疼痛记分数值相差1者，记为“疼痛缓解”；将记分数值相差2及以上者，记为“疼痛明显好转”。经卡方检验，疼痛明显好转率实验组与对照组比较，χ2=5.412，P=0.032，差异具有统计学意义(表3)。(2)张口度改善情况：治疗后第 2天患者的张口度增大<2 cm者，记为“缓解”；增大2 cm及以上者，记为”明显增大”。经卡方检验，实验组与对照组比较，χ2=5.412，P=0.032，差异具有统计学意义。

表3　实验药物对疼痛治疗的疗效比较(n=69)

3　讨论

智牙冠周炎发作时，细菌大量繁殖，需氧菌和厌氧菌并存，本实验选择对智牙冠周炎敏感的部分细菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的标准株和部分耐药株以及变形链球菌标准株，通过不同浓度AMPs和hLYZ复配，对上述细菌产生的抑制作用进行分析，发现两种药物联合使用后对部分菌株有协同抑菌作用，并且复配的比例因菌种不同而不同，在最大浓度组合即当DP7浓度为64 mg/L，hLYZ浓度为1 250 mg/L 时，对于敏感菌株都有协同抑菌作用；当DP7浓度为64 mg/L，hLYZ浓度为312.5mg/L时，对绝大部分菌株有协同抑菌作用。本组实验中hLYZ对照组的结果均为阴性，后续实验中考虑加大样本量、加大实验浓度观察。临床实验选择的复合多肽溶菌酶漱口水，主要由重组hLYZ100 U/L及DP7型AMPs 0.1 g/L复配而成，已开展对于口腔黏膜病的研究，其浓度配比与本组体外抑菌实验数据存在差异，在后续实验中将考虑此因素，对于不同口腔疾病选择更合适的浓度配比。

hLYZ是一种碱性球蛋白，广泛存在于人体的细胞、组织器官和体液中。它通过水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄胺中的β-1,4-糖苷键，在渗透压作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂，直接溶解G+细菌[2]。在分泌性免疫球蛋白A和补体协同作用下，也能间接溶解革兰氏阴性细菌。溶菌酶已在医疗、食品、生物学领域广泛应用，用于口腔溃疡、急慢性咽炎、烧伤创面、食品防腐与保存等[3-5]。hLYZ不易产生耐药性，是新一代抗菌剂的理想选择，它还能和抗生素、乳铁蛋白、溶菌酶等发生协同作用从而提高活性[6]。通过DNA重组技术获得了重组hLYZ，其纯度高，制备相对容易[7-8]。AMPs广泛存在于生物体内，在宿主天然免疫和获得性免疫中有很重要的作用[9]。其水脂双亲性、阳离子性、疏水性、a-螺旋结构、β-折叠、肽链长度、端基结构等都可影响其功能的发挥[10-12]，其主要抗菌机理是通过细胞膜渗透作用和直接作用于胞内不同靶点发挥抗菌作用,既能在细胞内部起作用，也能激活致死途径，诱导水解作用使细胞壁降解[13]。

综上所述，AMPs -DP7和hLYZ联合应用对引起智牙冠周炎的部分细菌具有良好的协同抑菌效果，对智牙冠周炎临床症状的改善有积极影响。由于本研究选择菌种有限，在后续研究中会继续增加其他常见冠周炎致病菌群，充实样本量，同时也发现更适宜的浓度比。在冲洗和含漱过程中，患者反映复合多肽溶菌酶漱口水口味过于浓烈，需待改进配方，减少刺激性。

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(学术编辑：刘英)

The application of composite polypeptide lysozyme on treatment of opsigenes pericoronitis

XIAO Ya-yi1,YANG Li2,MOU Yan-dong3

(1.Department of Stomatology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637100;2.State Key Laboratory of Biological Treatment,Sichuan University,Chengdu 610041;3.Department of Stomatology,Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu 610000,Sichuan,China)

Composite polypeptide lysozyme；Opsigenes pericoronitis；Synergistic antibacterial；Clinical curative effect

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.010论著

四川省科技支撑计划项目(2015SZ0013)

2016-01-19

萧雅一(1981-)，女，主治医师。E-mail：3138991746@qq.com

牟雁东，E-mail：995448060@qq.com

网络出版时间：2016-8-217∶48网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.018.html

1005-3697(2016)04-0486-04

R276.8

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