铜绿假单胞菌XJ601产鼠李糖脂的优化培养及其稳定性

罗　娜，董　文，何春秋，薛姝雯，李　晶，陈富林，，马艳玲

（1.西北大学生命科学学院，陕西西安710069；2.西安市油田微生物工程实验室，陕西西安710069）

铜绿假单胞菌XJ601产鼠李糖脂的优化培养及其稳定性

罗娜1，董文1，何春秋1，薛姝雯2，李晶2，陈富林1，2，马艳玲1

（1.西北大学生命科学学院，陕西西安710069；2.西安市油田微生物工程实验室，陕西西安710069）

以1株从原油污染样品中分离获得的铜绿假单胞菌XJ601为研究对象，采用蒽酮比色法定量分析鼠李糖脂，优化其产鼠李糖脂的培养基组成。研究表明:疏水性底物优于亲水性底物，具有更高的鼠李糖脂产量，尤以菜籽油最佳；氮源中，硝酸盐、NH4Cl能促进鼠李糖脂的合成，以菜籽油为碳源时，最佳氮源为NaNO3；C/N比值在20时，鼠李糖脂产量最高；P元素的微量添加会影响鼠李糖脂的合成。摇瓶培养获得的鼠李糖脂对不同温度、pH及NaCl浓度都具有较好的稳定性，表明其在三次采油及原油污染生物治理等领域具有较好的应用前景。关键词:铜绿假单胞菌；鼠李糖脂；优化培养基；稳定性；定量分析

生物表面活性剂是微生物产生的一类次级代谢产物，它既有与化学表面活性剂相同的能高效起泡、高效破乳、对特定界面具有选择性等特点，还具有生物或非生物毒性低、易于被微生物降解、结构多样等独特特点，在农业、医药、油田、化妆品及环境修复等领域有广泛应用前景［1-2］。鼠李糖脂是目前研究深入且应用最为广泛的生物表面活性剂，尤其在石油开采的过程中，常常通过添加微生物发酵产生的鼠李糖脂来达到降低水原油岩石之间界面张力的目的，这是近年来常用的提高原油采收率的方法［3-4］。在美国阿拉斯加发生的Exxon Valdez号油轮溢油事件中，通过添加生物表面活性剂来治理溢出油，在6周的时间内，石油中全部的正烷烃几乎被全部降解［5］。因此，鼠李糖脂生物表面活性剂的生产受到了广泛关注，研究能够使得微生物高效合成鼠李糖脂的方法将带来重要的社会和经济效益。

微生物合成鼠李糖脂的过程受到菌种本身、培养基、培养条件和培养时间等因素的影响，特别是培养基的组成［6］。目前，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是发酵产生鼠李糖脂应用最广泛的菌株之一，因为它可利用多种碳源合成鼠李糖脂。Zhu等［7］研究发现，以大豆油为唯一碳源和能源，在5 L体积的发酵罐中发酵鼠李糖脂，通过两阶段调控pH的方法，鼠李糖脂的产量可高达70.56 g/L。然而，添加不同亲、疏水性质的碳源底物，产生的鼠李糖脂及其副产物β-羟基脂酰-ACP（PHA）和β-羟基烷酰基β-羟基烷酸（HAA）的组成比例也有所不同，同时也会影响发酵产物的表面活性和乳化性能［8］。不仅碳源的种类会影响鼠李糖脂的生物合成，培养基中的氮源、C/N比、P和S等也有重要的影响。由此可见，正确权衡发酵原料中底物的特异性、发酵产物的表面活性组成成分以及产物生产量的稳定性，是利用微生物产生鼠李糖脂的研究重点。

笔者以1株从油井采出液中分离出的、能高效降解原油且能产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）XJ601为研究对象，研究不同碳源、氮源、C/N比、磷源对该菌产鼠李糖脂的影响，通过优化培养基各成分比来提高鼠李糖脂的产量，以期为鼠李糖脂的工业化生产提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1出发菌株

铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）XJ601，由本实验室成员从新疆油田油井采出液中分离纯化并鉴定。

1.1.2培养基

实验所用培养基有LB培养基和BPLM培养基，根据不同实验需求适当调整［9-10］。除有特殊要求的配制外，配制时都用蒸馏水定容至1 L，121℃高温湿热灭菌20 min，当培养基中含有葡萄糖时，115℃高温湿热灭菌30 min。

LB培养基:每1 L中含蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、NaCl 5.00 g；pH 7.0～7.2。若需要固体培养基时，每升加入13～15 g琼脂粉。

BPLM无机盐培养基:每1 L中含5 mL磷酸盐缓冲液（每1 L中含K2HPO4·3H2O 25.82 g、KH2PO48.70 g、Na2HPO4·12H2O 33.40 g、NH4Cl 5.00 g）、3 mL 22.50 g/L MgSO4溶液、1 mL 36.40 g/L CaCl2溶液、1.0 mL 0.25 g/L FeCl3溶液、1 mL微量元素溶液（39.90 mg/L MnSO4、42.80 mg/L ZnSO4·H2O、34.70 mg/L（NH4）7MoO24·4H2O）。

1.1.3试剂

H2SO4-蒽酮溶液（100 mL）:分析纯H2SO4（98%）稀释至85%，加入0.2 g蒽酮，搅拌至蒽酮溶解，现配现用。

1.2实验方法

1.2.1菌株活化和富集

将菌株XJ601划至新鲜的固体LB培养基上，过夜培养，挑取单克隆于新鲜的液体LB培养基中，培养12～16 h。4℃、8 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌水将菌体重悬，作为种子液备用。

1.2.2不同碳源对菌株XJ601产鼠李糖脂的影响

以BPLM培养基为基础，分别以菜籽油、豆油、甘油、柠檬酸钠、荧蒽、正辛烷为唯一碳源和能源，摇瓶发酵后定量分析发酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.3不同氮源对菌株XJ601产鼠李糖脂的影响

以BPLM培养基为基础，选取菜籽油为唯一碳源和能源，分别以NaNO3、NH4Cl、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、氨水（NH3·H2O）作为氮源，摇瓶发酵后定量分析发酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.4C/N比对菌株XJ601产鼠李糖脂的影响

以BPLM培养基为基础，选取上述获得的最佳碳源及最佳氮源设置C/N比，分别为2、6、10、15、20、25，摇瓶发酵后定量分析发酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.5磷源对菌株XJ601产鼠李糖脂的影响

以优化后的BPLM培养基为基础，分别添加或不加磷源，摇瓶发酵后定量分析发酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.6鼠李糖脂的提取及定量分析

取200 mL发酵液，8 000 r/min离心10 min，弃菌体，收集上清，将pH调至2，量取发酵液的体积，按照V（发酵液）∶V（氯仿）∶V（甲醇）=3∶2∶1的比例加入氯仿和甲醇，磁力搅拌器混匀10 min，8 000 r/min离心10 min，吸取下层氯仿层，烘干，计算质量差。

将发酵液稀释500倍，取1 mL至玻璃试管，同时取1 mL蒸馏水至另一个玻璃试管作为对照，将2支试管置于冰水混合物中冰浴3 min，取出立即加入蒽酮-H2SO4试剂，用力振荡试管摇匀，沸水浴5 min，至显色，取出冷却至室温，在620 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算鼠李糖脂的含量。

1.2.7鼠李糖脂临界胶束浓度（CMC）的测定

表面活性剂缔合成为胶束时的最低浓度称为表面活性剂的临界胶束浓度（CMC）［11］。本研究通过梯度稀释将表面活性剂稀释成不同的浓度，通过测定表面张力的方法测定了XJ601菌株产生的鼠李糖脂的CMC，同时测定了化学表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）的CMC，作图比较鼠李糖脂与SDS的乳化性能。

1.2.8不同因素对鼠李糖脂稳定性的影响

配制一定CMC浓度的鼠李糖脂（90 mg/L）和SDS（900 mg/L）溶液，分别在不同的温度、pH时处理2 h，利用表面张力仪测定表面张力，通过表面张力的变化和高低来比较鼠李糖脂和SDS在不同温度和酸碱度下的稳定性。在一定CMC浓度下的鼠李糖脂和SDS溶液中加入NaCl使其达到不同的终浓度，同样测定其表面张力，从而比较不同NaCl浓度下鼠李糖脂和SDS的稳定性。

2　结果与讨论

2.1BPLM培养基的优化

以BPLM为基础培养基，考察6种碳源、8种无机氮源对细胞生长和鼠李糖脂生产的影响。在培养基中添加不同碳源，考察其对细胞生长和鼠李糖脂生产的影响，结果见图1。由图1可知:菌株XJ601可利用多种碳源合成鼠李糖脂，菜籽油优于豆油、甘油、柠檬酸钠、荧蒽、正辛烷，是优选的较廉价碳源，具有更高的鼠李糖脂产量。

图1　碳源对XJ601菌株产鼠李糖脂的影响Fig.1 Effects of different carbon source on rhamnolipid production by strain XJ601

培养基中添加不同的氮源对鼠李糖脂产量也有显著影响，结果见图2。由图2可知:硝酸盐、NH4Cl等氮源能作为激活剂促进微生物对鼠李糖脂的合成，而氨水、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸等氮源则作为抑制剂抑制鼠李糖脂的合成。这是因为好氧微生物利用氮源时经硝化作用脱氮，将硝酸盐还原为分子氮或NO2，厌氧微生物经反硝化作用脱氮，将铵盐氧化为硝酸盐［12］。而铜绿假单胞菌为专性需氧菌，因此容易利用硝酸盐，因而以硝酸盐为氮源时鼠李糖脂的产量更高。

图2　氮源对XJ601菌株产鼠李糖脂的影响Fig.2 Effects of different nitrogen source on rhamnolipid production by strain XJ601

不仅碳源和氮源的种类影响鼠李糖脂的生物合成，C/N比值也有重要的影响，因此也考察了C/N比值对鼠李糖脂生物合成的影响，结果如图3所示。由图3可知，当C/N比值为20时，鼠李糖脂的产量最高。

综上可知，菜籽油及NaNO3分别为最佳的碳、氮源，而最佳的C/N比值为20，此时鼠李糖脂产量最高。

图3　碳氮比对XJ601菌株产鼠李糖脂的影响Fig.3 Effects of different C/N ratio on rhamnolipid production by strain XJ601

2.2优化前后细胞生长和鼠李糖脂产量的比较

对BPLM培养基进行优化前后的摇瓶平行培养，测定细胞密度和鼠李糖脂的产量，结果如图4所示。由图4可知:当用优化前的培养基发酵XJ601菌株时，鼠李糖脂的产量为14.08 g/L；用优化后的培养基发酵时，鼠李糖脂的产量为24.99 g/L。在优化后的培养基中，XJ601菌株产鼠李糖脂的量是优化前的1.78倍。就生物量曲线来看，用优化后的培养基发酵时，生物量也较优化前的略高。由此可见，优化后的培养基成分及配比更适合铜绿假单胞菌XJ601菌株生长和其次级代谢产物——鼠李糖脂的合成和分泌。优化后的BPLM培养基与优化前的培养基相比较，最大的特点是将前者培养基成分中的NH4Cl替换成了NaNO3。

图4　培养基优化前后XJ601菌株产鼠李糖脂的量比较Fig.4 Comparison of rhamnolipid productivity by strain XJ601 before and after medium components optimization

2.3磷源对XJ601菌株产鼠李糖脂的影响

磷源在培养基中不仅作为调节培养基环境的缓冲液，同时为细菌的核酸合成及其他代谢活动等提供磷元素，或作为相关基因表达的调控因子。Reis等［12］研究发现，磷源的添加可上调铜绿假单胞菌的QS系统（quorum sensing system）中rhlR基因的表达，从而影响鼠李糖脂的产量。因此，进一步考察磷源的添加对XJ601菌株产鼠李糖的影响，结果如图5所示。由图5可知:培养基中不添加磷源时，XJ601菌株产鼠李糖脂的量为12.93 g/L；BPLM培养基中正常加入了合适的磷源，XJ601菌株产鼠李糖脂的量为15.40 g/L；而当加入0.001 g/L的磷源，制造一个磷限制的环境，XJ601菌株产鼠李糖脂的量为21.98 g/L。由此可见，无磷环境中，由于核酸等物质不能顺利合成，需从其他补给途径合成，因此鼠李糖脂的产量和生物量都较磷限制环境和BPLM环境中低，而低磷浓度提高了鼠李糖脂产生相关基因rhlR基因的表达，增加了鼠李糖脂的产量。由于磷限制环境不仅提高了鼠李糖脂的产量，同时也激活了phzA1和phzA2等毒力因子的表达，增加了绿脓菌素等有害次级代谢产物的量，因此利用磷限制环境提高鼠李糖脂产量的方法在工业上还不能大规模使用，需进一步探究。

图5　磷源对XJ601产鼠李糖脂的影响Fig.5 Effects of different phosphorus source on rhamnolipid production by strain XJ601

2.4鼠李糖脂与SDS的临界胶束浓度（CMC）比较

CMC是衡量表面活性剂活性大小常用的重要指标。CMC的数值越小，表示此种表面活性剂在较低的浓度时就能形成胶团，达到表（界）面的饱合吸附，改变液体表面或界面性质所需的表面活性剂浓度越低。本实验通过将化学表面活性剂SDS和生物表面活性剂鼠李糖脂稀释成不同的浓度，分别测定表面张力，结果如图6所示。由图6可知:在10～1 000 mg/L时，SDS的质量浓度达到900 mg/L时，继续增加SDS的浓度，表面张力才趋于稳定；而鼠李糖脂的质量浓度达到90 mg/L时，继续增高鼠李糖脂的浓度，表面张力就已趋于稳定。即化学表面活性剂SDS的CMC为900 mg/L，生物表面活性剂鼠李糖脂的CMC为90 mg/L，这表明XJ601菌株产生的鼠李糖脂的乳化性能比化学合成的表面活性剂SDS的乳化性能高10倍。

图6　SDS与鼠李糖脂的CMC比较Fig.6 CMC comparison of SDS and rhamnolipids

2.5不同环境因素对鼠李糖脂稳定性的影响比较

通过改变温度、pH及NaCl浓度测定表面活性剂的表面张力，以化学表面活性剂SDS为参照，研究鼠李糖脂的稳定性，结果如图7所示。由图7（a）可知:在10～90℃处理鼠李糖脂时，鼠李糖脂溶液的表面张力均较为稳定，保持在24.4 mN/m左右基本不变；在-20～10℃和100～120℃时处理鼠李糖脂时，鼠李糖脂溶液的表面张力会有略微的波动，但依然相对稳定，保持在25.3 mN/m左右。由图7（b）可知:当pH处于3～11时，鼠李糖脂的表面活性基本没有影响，表面张力为24.5 mN/m；当pH大于11时，其表面张力逐渐升高，继续调高pH会产生絮状沉淀；而在强酸性的环境中，鼠李糖脂则较为稳定。由图7（c）可知:当NaCl质量浓度在25 g/L的范围内，鼠李糖脂的表面张力基本稳定不变，其表面张力为25.1 mN/m；随着盐浓度的增加，其表面张力会有略微的波动。由图7可以看出，无论是在较极端的酸碱环境、温度或盐度环境下，鼠李糖脂都比较稳定，而SDS波动都明显较大，鼠李糖脂比SDS更能耐受极端环境，也更能适应油田多变的环境。

3　结论

油田中分离出的菌株XJ601能够高效降解原油且能产生和分泌生物表面活性剂——鼠李糖脂，因而能够促进原油在水溶液中的乳化。将初始选用的BPLM培养基进行优化后，鼠李糖脂的产量与没有优化的培养基发酵相比提高了1.78倍，鼠李糖脂的CMC也比SDS低10倍，具有更好的乳化和增溶能力。与化学表面活性剂SDS相比，在高温、高盐、强酸、强碱等条件下，铜绿假单胞菌菌株XJ601合成的鼠李糖脂都有更好的稳定性，也更能适应油田多变的环境。

图7　环境因素对鼠李糖脂稳定性的影响Fig.7 Effects of different conditions on the stability of rhamnolipids

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（责任编辑 荀志金）

Effects of medium components on rhamnolipid production and its stability by Pseudomonas aeruginosa XJ601

LUO Na1，DONG Wen1，HE Chunqiu1，XUE Shuwen2，LI Jing2，CHEN Fulin1，2，MA Yanling1
（1.College of Life Science，Northwest University，Xi′an 710069，China；2.Oil Field Microbial Engineering Laboratory，Xi′an 710069，China）

The present work aims to investigate the effects of different medium components on rhamnolipid production by anthrone colorimetry quantitative analysis with Pseudomonas aeruginosa strain XJ601，which was isolated from crude oil-contaminated sample.The results showed that water-soluble and waterinsoluble carbon sources had been utilized forwere used to productione of rhamnolipids，while carbon sources such as vegetable oils were especially effective to produce rhamnolipid.With rapeseed oil as corbon source，nitrate was better than ammonium chloride as nitrogen source to enhance the production of rhamnolipids.Not only the type of carbon and nitrogen source but also the C/N ratio strongly influenced total rhamnolipid productivity，the highest final rhamnolipid concentration was observed at a C/N ratio of 20.The addition of P was also effective on the biosynthesis of rhamnolipids.The product of rhamnolipids by shake flask culture had good stability at different temperature and pH and different concentration of NaCl，which suggested that rhamnolipids produced by this strain hold much promise for oil recovery operations as well as for oil spill bioremediation.

Pseudomonas aeruginosa；rhamnolipid；optimization of medium components；stability；quantitative analysis

Q93

A

1672-3678（2016）03-0075-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.014

2016-01-11

国家高技术研究发展计划（863计划）（2013AA064402）；陕西省教育厅产业化培育项目（15JF032）

罗 娜（1990—），女，甘肃张掖人，研究方向:环境微生物；马艳玲（联系人），副教授，E-mail:mayanling@nwu.edu.cn