脊髓损伤后水通道蛋白-4在脊髓白质中的表达①

向虹雨，李胜男，曾　茜，张　晓，梁　楠

脊髓损伤后水通道蛋白-4在脊髓白质中的表达①

向虹雨，李胜男，曾茜，张晓，梁楠

目的探讨脊髓挫伤（SCC）后水通道蛋白-4（AQP-4）在脊髓白质中的表达变化。方法成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠88只，随机分为假手术组（Sham）和SCC组。Allen打击法建立SCC模型，BBB评分评价大鼠运动功能变化情况；免疫组织化学染色检测AQP-4在脊髓白质中不同时间点的定位情况；Q-PCR检测AQP-4 mRNA含量变化。结果SCC组BBB评分明显降低，损伤后7 d和14 d明显升高（t＞5.061，P＜0.01）。Q-PCR结果显示，术后1 d和3 dAQP-4 mRNA表达显著下降（t＞50.44，P＜0.001），损伤后5 d，AQP-4 mRNA表达水平较3 d明显上升（t=-3.968，P=0.001），直至28 d仍明显高于3 d（t=-4.227，P=0.001）。免疫组织化学染色结果显示，AQP-4主要定位于脊髓白质的血管内皮细胞和神经胶质细胞的突起。结论SCC后，AQP-4可能在脊髓损伤后不同时期发挥不同的病理生理作用。

脊髓挫伤；水肿；水通道蛋白-4；大鼠

［本文著录格式］向虹雨，李胜男，曾茜，等.脊髓损伤后水通道蛋白-4在脊髓白质中的表达［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：428-432.

CITED AS：Xiang HY，Li SN，Zeng X，et al.Expression of aquaporin-4 in white matter of spinal cord in rats after spinal cord contusion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：428-432.

脊髓损伤（spinal cord injury）是一种可致残性的创伤，分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。脊髓水肿为一种继发性损伤，其形成和消除与水通道蛋白（aquaporin，AQP）的表达水平有关［1］。AQP是一族跨膜蛋白，目前已发现13个亚型，其中AQP-4在脑和脊髓损伤后水肿中发挥重要的作用，它与脑脊液的重吸收、渗透压的调节、脑水肿的形成等有密切的关系，也有加速星形胶质细胞的移行、促进电兴奋细胞的神经信号传导功能等作用［2-8］。

AQP-4分布较广泛，主要分布于中枢神经系统，尤其是星形胶质细胞的终足和血管内皮细胞［9］。许多研究表明，无论是脑还是脊髓损伤后AQP-4的表达都会发生明显变化，从而影响组织中的血管源性水肿和细胞毒性水肿的发生和发展［10-15］。然而，目前对于脊髓挫伤（spinal cord contusion，SCC）后AQP-4在白质中的定位与基因变化情况尚未阐明。本实验通过建立大鼠SCC模型，应用免疫组织化学染色和定量-聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）等技术观察SCC后AQP-4在脊髓白质中不同时间点的表达和变化，为进一步研究AQP-4的表达变化对脊髓组织的损伤及恢复的影响提供实验依据。

1　材料和方法

1.1动物分组

健康成年Sprague-Dawley大鼠88只，雌性，体质量200～220 g，购于四川大学实验动物中心，合格证号SYXK2005-0004。采用随机数字表法随机分为假手术组（Sham）和脊髓顿挫损伤（SCC）术后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d组，其中Sham组16只；SCC组术后6 h、12 h各3只，其他时间点各11只。

Sham组和SCC组术后1 d、3 d、7 d、14 d各5只动物分别进行神经功能评分后，3只动物用于免疫组织化学染色，8只动物用于Q-PCR检测；6 h、12 h组3只动物均用于免疫组织化学染色。

1.2试剂与仪器

PBS缓冲液，批号ZLI-9062：北京中杉金桥生物技术有限公司。羊血清，批号10210-064：INVITROGEN公司。AQP-4抗体，批号ab46182：ABCAM公司。PV-9000试剂，批号PW140612：北京中杉金桥生物技术有限公司。GZX-GF-MBS-3（9203A）电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司。YC-2型层析实验冷柜：北京博医康实验仪器有限公司。Exceed-E-UP纯水仪：艾柯公司。DNP-9022-1A电热恒温培养箱：常州首创仪器设备有限公司。自制数字式脊髓损伤打击器。

1.3模型制备

3.6%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，备皮，常规消毒。以T10为中心，纵行切开皮肤及皮下组织，分离椎旁肌肉并暴露棘突与椎板，咬除T9椎板，模仿Allen法用自行加工设计的打击装置制备动物模型，即10 g冲击棒自30 mm高处自由坠落打击脊髓，依次缝合伤口。术后腹腔注射青霉素8万U，并协助大鼠排尿，每天早晚各1次，持续1～2周，至大鼠恢复反射性排尿。在此期间注意观察皮肤有无压疮或感染、下肢有无溃烂。Sham组大鼠仅剥离相应椎板，并不损伤脊髓即缝合伤口。所有动物饲养室温维持在25～ 30℃，正常饮食饲养。实验动物大鼠的模型操作和术后护理遵循中国实验动物保护和伦理委员会的规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。

1.4神经行为学评价

采用BBB评分（Basso-Beattie-Bresnahan）于手术当天及术后1 d、3 d、7 d及14 d对Sham组和SCC组大鼠进行后肢运动行为学评分，总分0～21分，完全功能缺失为0分，完全正常为21分。

1.5 Q-PCR

大鼠脊髓损伤后于相应的时间点取材，即大鼠麻醉后以损伤段为中心，取出损伤段脊髓5 mm，将取得组织放入冰水中，弃其软脊膜后，移入1.5 ml EP管中于-80℃冰箱保存。TRIzol试剂（每30～50 mg脊髓组织加1 ml TRIzol）提取总RNA，用两步法逆转录合成DNA（引物序列如表1）。AQP-4 PCR反应体系25 µl：95℃，3 min后，95℃变性15 s、53℃退火30 s、60℃延伸30 s，共45个循环PCR反应，最后60℃总延伸30 s后采集荧光。以β-actin为内参照，1 ml/L琼脂糖凝胶电泳，10倍上样缓冲液载样，溴化乙锭（EB）显色，电压110 V，时间25 min。紫外光透射下扫描凝胶，并进行图像分析。

表1　引物序列

1.6免疫组织化学染色

大鼠灌注取材后脱水、包埋，制备石蜡切片5 μm，采用PV-9000两步法进行免疫组织化学染色。切片经过梯度酒精水化后，3%H2O2预处理10 min，封闭内源性过氧化酶，0.01 mol/L PBS漂洗10 min，共3次；正常山羊血清在37℃温箱中封闭非特异性抗原10 min。加AQP-4一抗（rabbit，1∶100），4℃过夜，次日用PV-9000试剂A液和B液分别在37℃中孵育15 min，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分色，脱水、透明、封片。光学显微镜400×下观察免疫阳性反应物表达分布情况。

1.7统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。本实验所有数据均采用（x¯±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，使用Levene方法进行方差齐性检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1 BBB评分

Sham组各时间BBB评分为21分。大鼠SCC后1 d，BBB评分较Sham组明显降低，随后BBB评分随时间延长呈上升趋势。大鼠SCC后7 d、14 d BBB评分较1 d明显升高（P＜0.01）。见表2。

表2　SCC后大鼠BBB评分

2.2AQP-4 mRNA

AQP-4 mRNA表达水平在损伤后显著下降，损伤后1 d降至最低（P＜0.001）。损伤后5 d，AQP-4 mRNA表达水平相比于3 d明显上升（P＜0.01），直至28 d仍明显高于3 d（P＜0.01）。见表3。

2.3AQP-4在脊髓白质的表达定位

在脊髓白质区，AQP-4阳性反应物主要分布于神经胶质细胞突起和血管内皮细胞，尤其是星形胶质细胞的突起染色较深，少突胶质细胞和小胶质细胞也可见少量AQP-4的棕色阳性产物。SCC后6 h，AQP-4在脊髓白质中血管内皮细胞和星形胶质细胞的棕色反应物颜色变浅；SCC后12 h，血管内皮细胞的棕色反应物颜色明显比星形胶质细胞深；损伤后1～3 d，胶质细胞中棕色反应物明显减少，血管周围棕色反应物增加。从损伤后7 d开始，血管内皮细胞的AQP-4阳性反应物明显减少，而在胶质细胞突起有所增加；直到第28 d，AQP-4在胶质细胞和血管内皮细胞的表达基本恢复到Sham组水平。见图1。

3　讨论

本实验建立了大鼠SCC模型，BBB评分证明损伤模型制备成功，Q-PCR技术和免疫组织化学技术分别观察AQP-4的基因表达和定位改变；结果表明SCC早期AQP-4基因表达下降且蛋白主要表达于脊髓白质神经胶质细胞的突起和血管内皮细胞，而晚期AQP-4基因表达增加但蛋白在血管内皮的表达明显减少，提示了AQP-4在SCC后不同时期可能发挥不同的病理生理作用。

3.1 SCC后AQP-4在脊髓白质的表达与定位变化

脊髓损伤后AQP-4在脊髓组织中的表达定量与定位均有明显变化。Q-PCR结果显示，SCC后AQP-4在大鼠脊髓组织中的表达早期下降而后有所升高。此外，本项目采用组织芯片技术制备组织切片，使我们能够在同一张石蜡切片上观察不同时间点的脊髓组织，以排除免疫组织化学染色实验对研究结果的干扰，连续观察SCC后AQP-4表达的时空变化。结果显示，AQP-4在正常脊髓白质的血管内皮细胞和星形胶质细胞的突起均有表达，表明AQP-4对维持脊髓正常生理功能起到一定作用；SCC后6 h，白质中AQP-4在血管内皮细胞和星形胶质细胞的表达水平降低；损伤后12 h，AQP-4在血管内皮细胞表达相较于星形胶质细胞有所增加；损伤后1～3 d，AQP-4在星形胶质细胞中的表达继续下降，且在血管内皮细胞表达进一步增加。然而，从第7天开始，AQP-4在血管内皮细胞表达显著减少，但在胶质细胞突起表达增加，表明7 d后AQP-4主要表达在胶质细胞的突起。

目前，已有大量实验证明，脊髓损伤后AQP-4在脊髓组织中的表达有明显变化。Nesic等建立了SCC模型，定量定位研究SCC前后AQP-4的表达情况，并对水含量进行测量，结果表明SCC前后随着水含量的改变，AQP-4的表达在时间和空间上均发生变化［16］。Lan等研究发现，AQP-4在脑损伤中表达也会随着脑含水量的改变而改变［17］。此外，Papadopoulos等也证明AQP-4在脊髓水肿的病理生理过程中起重要作用，小鼠脊髓压迫性损伤后，脊髓水肿程度改变的同时，AQP-4的表达与定位均发生变化［12］。

表3　AQP-4 mRNA在脊髓组织中的相对表达量（n=8）

图1　AQP-4在脊髓白质的表达（免疫组织化学，400×）

3.2 AQP-4在脊髓损伤中的作用可能随时间推移发生改变

在本研究中，我们观察到在SCC后脊髓白质中的AQP-4在血管内皮细胞的表达逐渐增加后又逐渐减少的同时，胶质细胞突起的AQP-4表达减少后明显增加，这提示SCC后AQP-4在不同时期可能在不同的部位行使不同的功能。目前，有许多研究表明，中枢神经系统损伤后，存在两种水肿形式即血管源性水肿和细胞毒性水肿，而AQP-4作为中枢神经系统重要的AQP可能同时参与两种水肿的发生或发展。Papadopoulos等建立小鼠脑水肿模型，证明AQP-4基因缺乏小鼠的脑血管源性水肿较野生型小鼠有明显加重［18］。Bloch等也证明AQP-4对组织间隙中多余水分的消除起重要作用［19］。Zador等建立小鼠脑损伤模型，证明脑损伤导致脑组织间隙水含量显著增加，且AQP-4基因敲除小鼠的脑组织间隙水含量显著增加；由此推测脊髓损伤后AQP-4在血管内皮的大量表达对脊髓组织血管源性水肿的消除可能有重要作用［20］。而Saadoun等发现在AQP-4基因缺乏型小鼠中脑损伤后脑细胞水肿加剧［21］。此外，还有大量研究证明AQP-4促进脑或脊髓损伤后细胞毒性水肿的发生［22-26］。值得注意的是，也有研究表明AQP-4在人脑损伤后，脑细胞内外水含量的调节起重要作用［27］。因此我们认为AQP-4在星形胶质细胞表达的增加可能直接导致细胞毒性水肿的发生。

综上所述，AQP-4会在脊髓损伤后的不同时期不同部位表达，因此AQP-4可能对脊髓损伤的不同时期产生不同作用。

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Expression ofAquaporin-4 in White Matter of Spinal Cord in Rats after Spinal Cord Contusion

XIANG Hong-yu，LI Sheng-nan，ZENG Xi，ZHANG Xiao，LIANG Nan
Center for Experimental Technology for Preclinical Medicine，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China
Correspondence to LIANG Nan.E-mail：liangnan_1999_0@163.com

Objective To explore the expression of aquaporin（AQP）-4 in white matter of spinal cord after spinal cord contusion（SCC）. Methods 88 adult Sprague-Dawley rats were assigned randomly to sham operation group and SCC group.The model was established by Allen's method.BBB sore was used to assess the motor function of rats.The relative expression of AQP-4 mRNA was determined by Q-PCR technique.The localization of AQP-4 was observed by immunohistochemistry.Results BBB score showed motor dysfunction in SCC group，and it increased 7 and 14 days after SCC（t＞5.061，P＜0.001）.The level of AQP-4 mRNA decreased on the 1st and 3rd days（t＞50.44，P＜0.001），and increased on the 5th day（t=-3.968，P=0.001），and lasted until the 28th day（t=-4.227，P=0.001）compared with that on the 3rd day.The immunohistochemistry showed AQP-4 was located on the process of glial cell and vascular endothelial cells in white matter of spinal cord.ConclusionAQP-4 may play various roles at different stages in SCC.

spinal cord contusion；edema；aquaporin-4；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.012

R651.2

A

1006-9771（2016）04-0428-05

四川省级大学生创新创业训练计划项目（No.201313705030）。

成都医学院基础医学实验教学中心，四川成都市610500。作者简介：向虹雨（1993-），男，汉族，四川苍溪县人，本科生。通讯作者：梁楠，女，汉族，硕士，讲师，主要研究方向：中枢神经损伤相关机制与治疗。E-mail：liangnan_1999_0@163.com。

（2015-11-02

2015-12-10）