迷走神经电刺激对脑外伤昏迷大鼠前额叶皮质5-羟色胺2A受体表达的影响①

董晓阳，冯　珍

迷走神经电刺激对脑外伤昏迷大鼠前额叶皮质5-羟色胺2A受体表达的影响①

董晓阳，冯珍

目的探讨迷走神经电刺激对脑外伤昏迷大鼠促醒作用及对前额叶皮质5-HT2A受体表达的影响。方法将72只Sprague-Dawley大鼠随机分为空白对照组、假刺激组、刺激组和拮抗剂组，每组18只。应用自由落体撞击法建立脑外伤昏迷模型。拮抗剂组注入OXR1受体拮抗剂SB334867，采用迷走神经电刺激治疗刺激组和拮抗剂组。观察其行为学变化，并用免疫组织化学技术检测各组大鼠前额叶皮质5-HT2A受体表达的影响。结果刺激组12只苏醒，拮抗剂组9只苏醒，假刺激组4只苏醒。5-HT2A受体含量从低到高依次为：空白对照组、拮抗剂组、假刺激组、刺激组（χ2=11.464，P=0.009）。结论迷走神经电刺激可提高脑外伤昏迷大鼠意识状态，其机制可能与上调5-HT2A受体有关。

脑外伤；昏迷；迷走神经电刺激；5-羟色胺2A受体；食欲素A；大鼠

［本文著录格式］董晓阳，冯珍.迷走神经电刺激对脑外伤昏迷大鼠前额叶皮质5-羟色胺2A受体表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：404-408.

CITED AS：Dong XY，Feng Z.Effect of vagus nerve stimulation on expression of 5-hydroxytryptamine 2A receptor in prefrontal cortex of coma rats with traumatic brain injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：404-408.

专家预测，脑外伤在2020年将成为全球第三大疾病负担［1］。随着脑外伤救治技术的进步，脑外伤患者的死亡率有明显下降，但是仍有高达14%的脑外伤患者经抢救后处于长期昏迷或植物状态，从而降低了患者和家庭的生活质量，增大了医疗费的支出压力［2］。昏迷促醒的治疗一直以来是临床上的重点和难点，目前治疗脑外伤后昏迷的方法有药物治疗、高压氧治疗、音乐疗法、中医中药及针灸治疗、电刺激治疗等［3］。电刺激治疗主要包括深部脑刺激（deep brain stimulation，DBS）、颈部脊髓硬膜外刺激（cervical spinal cord stimulation，cSCS）、正中神经电刺激（median nerve electrical stimulation，MNES）、迷走神经电刺激（vagus nerve electrical stimulation，VNS）等。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是一种兴奋性神经递质，5-HT2A受体（5-HT2AR）主要与睡眠觉醒相关，本次研究旨在探讨VNS对脑外伤昏迷大鼠的促醒效果及对5-HT2AR变化的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物、材料及仪器

成年Sprague-Dawley大鼠72只，体质量250～300 g，普通级，由南昌大学医学部动科部提供，适应环境饲养1周后开始实验。抗5-HT2AR（BA2048）：武汉博士德有限公司。

抗β-actin单克隆抗体（CW0096）、组织蛋白抽提试剂盒（CWB10）：北京康为世纪生物科技有限公司。食欲素1受体拮抗剂（SB334867）：美国Tocris bioscience公司。ZS-BS数显脑立体定位仪：北京众实迪创科技发展有限公司）。电刺激仪（ES-420）：日本伊藤超短波株式会社。切片机（RM2015）：LEICA。

1.2模型建立及分组

本实验应用经典“自由落体撞击法”来构建动物模型。乙醚吸入性麻醉，麻醉起效后暴露颅骨顶部，于左侧中线旁2 mm、冠状缝前1 mm用注射器针头在颅骨表面“十”字标记打击点。根据体质量不同，400 g圆柱形撞击锤从38～42 cm高度沿垂直金属杆自由下落，撞击左侧颅骨表面打击点上的薄铝垫片，致使颅骨凹陷性骨折，消毒后缝合皮肤，放回笼中。1 h后根据大鼠的感觉、运动功能，将大鼠意识状态分6级：Ⅰ级，在笼内活动如常；Ⅱ级，在笼内活动减少；Ⅲ级，在笼内活动减少并运动失调；Ⅳ级，当背部放在笼的底部时能滚动（翻正反射存在）但不能站立；Ⅴ级，翻正反射消失但对疼痛刺激有肢体回缩反应；Ⅵ级，对任何刺激无反应。Ⅴ级、Ⅵ级纳入实验［4］。

将72只大鼠随机分为空白对照组（普通健康大鼠）、假刺激组（脑外伤昏迷大鼠）、刺激组（脑外伤昏迷+VNS），拮抗剂组（脑外伤昏迷+OXR1受体拮抗剂SB334867+VNS），每组18只。在造模过程中有10只大鼠死亡，再次挑选新的大鼠进行补充。

1.3侧脑室注射食欲素1受体受体拮抗剂

腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉脑外伤后大鼠，待麻醉起效后，对大鼠头顶部消毒，暴露颅骨，将大鼠头部及四肢俯卧位固定于脑立体定位仪上，于前囟后约1.0 mm、正中线旁开1.5 mm标记基点后，用颅骨钻在标记基点钻孔，用微量进样器吸入SB3348675 μl（10 mg/kg粉末溶解于60∶40 DMSO），垂直注入颅骨表面下4.5 mm。微量泵参数：速度2.50 μl/min，时间2 min，启动微量泵，注射完毕后留针2～3 min退针。缝合头皮，消毒，放置于加热垫上，观察反应，1 h后继续给予VNS。

1.4 VNS

刺激组和拮抗剂组需要进行VNS。将大鼠置入无菌环境下，手术前用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，硫酸庆大霉素0.1 ml/100 g肌肉注射预防感染。待麻醉起效后固定于手术台，左侧颈部消毒，靠近颈部正中线切开皮肤，钝性分离皮下脂肪、唾液腺、肌肉（胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌），切开颈动脉鞘（迷走神经和颈动脉），分离左侧迷走神经5 mm。将特制刺激电极包绕迷走神经，通过灵敏电流表检测电极是否与迷走神经接触良好，检测接触良好后给予电刺激。刺激之后取出电极，缝合手术切口，将大鼠放置于温床30 min，然后放回笼中。VNS治疗参数［5］：频率30 Hz，脉宽0.5 ms，电流1.0 mA，刺激总时间为15 min。刺激结束后1 h，再次评估意识状态等级评分，实验完毕后放回笼中。假刺激组则按刺激组同样操作，但无电流输出。

1.5免疫组化染色

在实验结束后1 h，再次评定大鼠意识状态。实验完成后的6 h、12 h、24 h，腹腔注射10%水合氯醛0.1 g/ml深度麻醉后，向心脏灌注4%多聚甲醛至全身僵硬，断头取脑，4%水合氯醛固定12 h，并在20% PBS中冷冻保存。按此方法每组每个时间点均处死6只。脑组织冠状切片，片厚4 μm，PBS漂洗后0.3%的H2O2处理30 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育1 h，滴加稀释的兔抗5-HT2AR抗体（1∶400），4℃过夜，PBS漂洗后再滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h。由两位有经验的病理实验师观察免疫组化结果，最后计算出免疫组化得分（immunohistochemical score，IHS）。

1.6统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。不同组别和时间点的5-HT2AR含量以秩均值表示，作Kruskal-Wallis H秩和检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1行为学评估

治疗后1 h，刺激组中，12只大鼠苏醒（Ⅲ级8只，Ⅳ级4只）；6只仍昏迷（Ⅴ级4只，Ⅵ级2只）。拮抗剂组中，9只苏醒（Ⅲ级4只，Ⅳ级5只）；9只昏迷（Ⅴ级4只，Ⅵ级5只）。假刺激组中，4只苏醒（Ⅲ级2只，Ⅳ级2只）；14只昏迷（Ⅴ级8只，Ⅵ级6只）。治疗之后大鼠苏醒的数量（Ⅴ～Ⅵ级）顺序为：假刺激组＜拮抗剂组＜刺激组＜空白对照组。

2.2免疫组化检测

5-HT2AR分布于前额叶皮层神经元的胞浆和胞膜中。见图1。

组间比较4组5-HT2AR的表达水平呈有非常显著性差异（P＜0.05），空白对照组＜拮抗剂组＜假刺激组＜刺激组。见表1。

3个时间点的5-HT2AR的表达水平无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

表1　不同组别5-HT2AR表达（秩均值）

表2　不同时间点5-HT2AR表达

3　讨论

VNS已广泛应用于难治性癫痫和持续性、复发性抑郁及认知功能障碍等［6］。近年来，研究表明VNS可减少脑外伤后癫痫患者白天嗜睡时间和快动眼睡眠周期（rapid eye movement，REM），延长觉醒时间，但其机制尚不完全明晰［7］。目前认为VNS延长觉醒时间的可能作用机制如下。

①迷走神经广泛的纤维投射。80%迷走神经传入纤维止于孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS），小部分止于三叉神经脊束核、网状结构和疑核等，传入神经可直接投射到大脑皮层和间接通过NTS到达网状上行激活系统（ascending reticular activating system，ARAS）［8］。ARAS是激活和维持觉醒的重要组成部分，电刺激迷走神经可提高ARAS信号输入，进而可能达到促醒作用。

②影响脑电活动。VNS可提高REM之前的慢波睡眠（slow-wave sleep，SWS）并能够增加REM的频率，此外，睡眠梭状波及δ波普显著增加［9］。

③抗炎效应。迷走神经介导的抗炎效益主要是通过胆碱能抗炎通路实现，抑制炎症细胞因子释放避免神经细胞的第二次损伤［10］。

④改善脑部血流量。VNS可提高丘脑、下丘脑、前额叶皮层、网状结构等与觉醒密切相关脑区的脑血流量，脑血流量的增加对细胞存活，促醒神经功能的恢复具有重要的意义［11］。

⑤增加神经营养因子的表达和增强突触可塑性。神经营养因子在调节神经元存活、生长、功能及可塑性中扮演着重要的作用。VNS可促进脑源性神经生长因子和神经生长因子在海马区、大脑皮层及前额叶区域中的表达［12］。

⑥影响脑内相关神经递质的改变。研究表明VNS可提高下丘脑和前额叶皮层细胞内去甲肾上腺素水平、中缝背核的5-HT、前额叶和伏核的多巴胺水平等［13-14］。

⑦其他机制，包括VNS可促进内源性神经干细胞的增长、影响细胞去极化活动水平、降低颅内压、减少梗死面积、减轻大脑水肿程度及降低血脑屏障的损伤等［15］。

因此，VNS有望成为脑外伤昏迷促醒的有效方法。本次研究旨在探讨VNS昏迷促醒效果和对前额叶5-HT2AR表达变化的影响。

5-HT又称为血清素（serotonin），存在于机体多种组织，神经系统中的5-HT主要参与机体对摄食、性行为、神经内分泌、疼痛感知、学习记忆和情绪、睡眠-觉醒等生理过程的调控［16］。5-HT有7个受体亚型，其中5-HT2AR在脑内分布广泛，特别是高密度分布于前额叶皮层，与觉醒的调节密切相关。

图1　前额叶各组各时间点5-HT2AR表达（免疫组化染色，400×）

Yuen等发现5-HT可抑制钾离子通道，增加突触前谷氨酸的释放，进而激活5-HT2AR兴奋前额叶皮层神经元［17］。Monti等研究证明，向老鼠体内注入非选择性5-HT2AR拮抗剂可减少非快速动眼睡眠和快速动眼睡眠，增加觉醒［18］。随后，Yoshida等在鼠胚胎皮层神经元中发现5-HT2A/2C激动剂可促进树突棘的形成与成熟［19］；在体外，Ohtani等也证明，在老鼠皮层神经元内，5-HT2AR可调节树突棘的形态变化［20］。因此，5-HT2AR在促觉醒和神经元发育方面扮演着重要的角色。

本研究发现各组苏醒大鼠数量呈假刺激组、拮抗剂组、刺激组、空白组依次递增，表明VNS具有意识改善的效果。此外，通过免疫组织化学技术检测发现5-HT2AR含量呈空白组、拮抗剂组、假刺激组、刺激组依次递增，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。刺激组明显高于假刺激组，表明VNS可上调5-HT2AR表达；假刺激组高于空白组，可能是由于脑外伤后应激保护作用引起5-HT2AR高表达。我们前期研究发现，VNS可上调食欲素A和食欲素1受体表达进而促进觉醒且食欲素A扮演着关键性作用，但食欲素A是否影响5-HT2AR表达尚不明晰，本实验通过侧脑室注射食欲素1受体拮抗剂SB334867进而给予VNS，发现拮抗剂组大鼠苏醒的数量和前额叶5-HT2AR表达含量均低于刺激组，进一步表明食欲素A能够影响VNS促进觉醒的效果，其机制之一可能与调节5-HT2AR水平有关，但具体的分子机制有待进一步研究。组内比较发现，6 h、12 h、24 h 3组5-HT2AR含量无明显差异，可能是由于VNS作用于机体的反应期有关。

综上所述，VNS对脑外伤昏迷大鼠具有促进意识恢复的效果，其作用机制可能与5-HT2AR的高表达有关，且在这一过程中食欲素A参与调节。但VNS促昏迷觉醒的效果尚无直接报道，需要进一步研究证实。

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Effect of Vagus Nerve Stimulation on Expression of 5-hydroxytryptamine 2A Receptor in Prefrontal Cortex of Coma Rats with Traumatic Brain Injury

DONG Xiao-yang，FENG Zhen
Department of Rehabilitation Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China
Correspondence to FENG Zhen.E-mail：fengzhenly@sina.com

Objective To explore the effect of vagus nerve stimualtion on wake-promoting and the expression of 5-hydroxytryptamine（5-HT）2A receptor in the prefrontal contex of coma rats with traumatic brain injury.Methods 72 Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，sham-stimulated group，stimulated group and antagonist group with 18 rats in each group.Traumatic brain injury model was established by a weight-drop head injury.The antagonist group was injected with SB334867，and both the antagonist group and the stimulated group received vagus nerve stimulation.Their behaviors were recorded.And immunohistochemistry technique was used to detect the expression of 5-HT2Areceptor in the prefrontal cortex.Results 12 rats in the stimulated group，9 in the antagonist group and 4 in the sham-stimulated woke up.The expression of 5-HT2Areceptor from low to high was ranged as the control group，the antagonist group，the sham-stimulated group and the stimulated group（χ2=11.464，P=0.009）.Conclusion Vagus nerve stimulation could raise consciousness in coma rats after traumatic brain injury，which may be related to up-regulating the expression of 5-HT2Areceptor.

traumatic brain injury；coma；vagus nerve stumulation；5-hydroxytryptamine 2Areceptor；orexin-A；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.007

R651.1

A

1006-9771（2016）04-0404-05

1.国家自然科学基金项目（No.81260295）；2.江西省研究生创新基金（No.YC2015-S090）。

南昌大学第一附属医院康复医学科，江西南昌市330006。作者简介：董晓阳（1991-），男，江西九江市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复。通讯作者：冯珍，女，江西南昌市人，教授，主任医师，主要研究方向：神经康复。E-mail：fengzhenly@sina.com。

（2015-12-15

2016-01-18）