不随意运动型脑性瘫痪血清代谢轮廓的特征分析①

陈俊臣，何　霞，段　宇，彭云川，张明伟

不随意运动型脑性瘫痪血清代谢轮廓的特征分析①

陈俊臣1，2，何霞2，段宇2，彭云川2，张明伟1

目的利用代谢组学方法研究不随意运动型脑瘫患儿血清代谢的轮廓特征，分析其异常代谢通路。方法收集2014年5～8月本院门诊诊断的10例6～12岁不随意运动型脑瘫患儿（患儿组）及7名正常儿童（对照组）的血清样本，利用代谢组学方法，将所有血清样本进行核磁共振扫描，所得到的核磁图谱进行分段积分，利用偏最小二乘法模型对积分矩阵回归分析，分离对照组，计算特征化学位移段。在代谢数据库中查询小分子代谢产物，分析不随意运动型脑瘫患儿代谢轮廓扰动差别。结果在偏最小二乘法模型中，15个重要变化化学位移段被确定，其中2.04 ppm、2.12 ppm、3.00 ppm、3.24 ppm、3.76 ppm、6.50 ppm信号值有显著性差异（P＜0.05）。通过生物核磁数据库发现谷氨酸、酮戊二酸、谷氨酰胺、亮氨酸、左旋丙氨酸水平升高；而牛磺酸、延胡索酸、草酰乙酸、丙酮酸、柠檬酸、天门冬氨酸、琥珀酸、苹果酸、半胱氨酸水平下降。在代谢数据库中进一步分析发现，不随意运动型脑瘫患儿血清中牛磺酸代谢通路、谷氨酸代谢通路和能量代谢通路波动异常。结论基于代谢组学偏最小二乘法模型能成功区分不随意运动型脑瘫代谢轮廓，该实验发现异常波动的代谢产物及代谢通路可成为进一步研究的重点。

脑性瘫痪；不随意运动型；代谢组学；核磁共振波谱；偏最小二乘法

作者单位：1.四川医科大学中西医结合学院（附属中医医院神经外科），四川泸州市646000；2.四川省康复医院，四川成都市611135。作者简介：陈俊臣（1982-），男，汉族，四川仪陇县人，主治医师，主要研究方向：小儿脑性瘫痪，颅脑创伤。通讯作者：张明伟（1973-），男，汉族，四川简阳市人，主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：小儿脑性瘫痪，颅脑外伤创伤的基础与临床。E-mail：drcc82@163.com。

［本文著录格式］陈俊臣，何霞，段宇，等.不随意运动型脑性瘫痪血清代谢轮廓的特征分析［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：448-454.

CITED AS：Chen JC，He X，Duan Y，et al.Metabolic profile of dyskinetic cerebral palsy based on metabonomics［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：448-454.

脑瘫是由发育不成熟的大脑（产前、产时或产后）先天性发育缺陷（畸形、宫内感染）或获得性（早产、低出生体重、窒息、缺氧缺血性脑病、核黄疸、外伤、感染）等非进行性脑损伤所致［1］。脑瘫是儿童时期最常见致残因素，给个人带来巨大生理及心理痛苦，也给家庭和整个社会造成巨大的负担［2］。不随意运动作为脑瘫的一种亚型，约占整个脑瘫患者的17%，主要包括舞蹈性手足徐动和肌张力障碍；该型最明显特征是非对称性姿势，头部和四肢出现不随意运动，目前并没有十分有效的治疗方式［1，3］。研究发现，有相当一部分患儿是由于本身携带致病基因或其他代谢因素失调，因诊断不明而归为脑瘫［4］。例如，多巴胺反应型肌张力障碍，常与不随意运动型脑瘫表现相似，因为自身基因缺陷导致体内多巴胺代谢障碍，小剂量多巴胺制剂对其治疗效果良好［5］；精氨酸血症，为体内精氨酸代谢障碍，在体内堆积，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，常导致儿童期的痉挛性瘫痪［6］；葡萄糖转运体-1缺乏综合征也可导致小儿难治性癫痫、发育迟缓、复杂性运动障碍［7］。脑瘫是一组典型征候群，常出现误诊误治，其内部代谢也可能出现特征性变化。

代谢组学是通过考察生物体系内小分子代谢产物图谱及其随时间动态变化特点的学科，与基因组学、转录组学和蛋白质组学共同构成了系统生物学的研究体系。现已广泛应用于包括疾病的诊断、药理学、病理生理学、营养学、环境科学和材料学等重要领域［8］。常用的检测手段包括核磁共振（nuclear magnetic resonance）、质谱和色谱分析等，其检测的生物体液波谱具有高通量特征，包含上千种小分子物质信息。对不同特点的波谱，需要建立数学模型分析，其中非监督性模式识别中的主成分分析（principal component analysis，PCA）和监督性模式识别中的偏最小二乘法-判别分析（partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA）是最常用的分析方法［9］。

目前基于核磁共振的代谢组学技术，在许多儿科疾病的发病机制研究中发挥重要作用，如孤独症［10］、Ⅰ型糖尿病［11］、哮喘［12］及中枢性肿瘤［13］等已有运用。虽然也有文章提示代谢组学作为一种新的研究方法在肌张力障碍疾病中研究的可行性，但并没有提出具体的代谢扰动途径［14］。

本研究利用代谢组学技术对不随意运动型脑瘫与正常儿童的血清进行核磁共振波谱分析，希望从中发现有关该型患儿的异常代谢状态关键点，为进一步研究提供可靠线索。

1　资料与方法

1.1一般资料

2014年5～8月，四川省康复医院功能神经外科门诊，经副主任医师以上的专家确诊的不随意运动型脑瘫患儿纳入研究。

诊断标准［1］：①中枢性运动障碍持续存在；②运动和姿势发育异常；③以锥体外系受损为主，不随意运动增多的临床表现；④反射异常；⑤肌力、肌张力异常。

纳入标准：①年龄6～12岁；②有明确的围产期及发育期的脑损伤病史；③粗大运动功能分级Ⅰ～Ⅲ级；④头部MRI脑损伤表现为陈旧、静止性；⑤6个月内未服用任何药物。

排除标准：①原发性或进行性运动障碍病；②其他严重的并发症，如癫痫、智力障碍、行为异常等；③伴有牵张反射亢进、病理反射阳性的临床表现；④其他发育迟缓疾病。

对照组为相仿年龄段健康儿童。实验实施前，每名儿童监护人被告知实验目的和相关方案，并征得同意。实验计划经四川省康复医院伦理委员会批准。

纳入实验儿童均记录性别、年龄、身高、体质量并计算体质量指数（body mass index，BMI）。

采用SPSS 19.0进行分析。利用独立样本t检验对患儿组及对照组年龄、身高、体质量及BMI进行分析。

1.2样本采集和制备

所有入选对象于清晨6时，空腹8 h后，采集静脉血4 ml。采血前1 d按日常生活饮食活动，禁止高脂高蛋白饮食及剧烈活动或康复训练。血液样本在室温下自然凝固1 h，采集上层血清，置-70℃超低温冰箱备用。

1.3样本检测

在四川大学分析测试中心核磁共振实验室进行检测。血清样本编号加入重水后置于核磁管中，放于600 MHz核磁仪中进行检查。实验参数：谱宽8000 Hz，采样点数32 K，采样时间2 s，累加次数64次，t为400 ms，2 nt为320 ms，弛豫延迟为2 s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。以甲乳酸基双峰信号的左侧峰定义为d1.33，然后调整相位并进行基线校正。后将所有样本的自由感应衰减信号导入核磁解析MESTREC（version 4.4.0）软件，进行傅立叶转换后，获得氢核核磁共振波谱（1H-NMR）。将0.00～8.00 ppm范围内的化学位移在MESTREC按照0.04 ppm进行分段积分，得到200个波谱强度值。为了减少系统误差，在进行模式识别分析前对分割后的目标积分段值进行加合和归一化处理。所得数据输出并转换到Excel文件。

1.4多元统计分析

将a名患儿和b名正常儿童的核磁波谱信号分段积分，得到矩阵A和矩阵B。行代表每个纳入实验儿童，列代表200个化学位移段积分后的信号强度值。A代表不随意运动脑瘫患儿组，B代表正常儿童组，用于模式识别分析。

本实验首先将A矩阵和B矩阵无差别地在Matlab平台中进行主成分分析，其作为无监督判别模式，并没有将两组样本有效区分。

再对A矩阵和B矩阵在Matlab偏最小二乘法平台中中提前分组（监督模式），进行PLA-DA判别。

目的一：建立PLS-DA模型，并了解模型是否具有可重复性和可预测性。目的二：如果模型稳定，设定模型重要变量参数（variable important parameter，VIP）值为1.70，计算出在模型中影响A、B矩阵分离最大的化学位移段。在SPSS下，通过配对样本的t检验验证VIP化学位移段信号值是否具有统计学意义（α=0.05）。

1.5代谢产物的确定

特定的化学位移段是不同分子或化学结构在磁场中不同的衰减变化信号，通过代谢数据库（http：//www. hmdb.ca/）推测代谢产物。

人体内的代谢产物之间的相互作用关系、基因调控和酶作用变化，可以通过查阅KEGG代谢通路数据库（KEGG Pathway Database），进一步分析得出。

2　结果

2.1纳入对象

经严格筛选，10例不随意运动型脑瘫患儿纳入本实验，其中男性6例，女性4例，年龄6～12岁，平均8.9岁。病因包括产时缺氧、黄疸、高热惊厥和脑出血，头颅MRI检查，除10号患儿外，均有异常表现（表1）。10例患儿均有不随意运动表现，但查体均无病理征或反射亢进；患儿都有不同程度的语言障碍（表2），但均能听懂指令，无明显智力障碍和行为异常。

对照组7名健康儿童，年龄6～11岁，平均8.9岁。年龄与患儿组无显著性差异（P＞0.05）。

不随意运动型脑瘫患儿身高、体质量均落后于正常儿童，但无显著性差异（P＞0.05）。患儿大多身体瘦小，BMI小于对照组（P＜0.05），见表3。

2.2多变量分析

血清的核磁波谱信分段积分后数值导入到Matlab偏最小二乘法判别工作平台，PLS-DA模型成功建立后，通过得分图可以观察到患儿组和对照组代表散点在第一主成分（t1）和第二主成分（t2）区分情况（图1）。模型的参数R2表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率。该模型R2=0.832，Q2=-0.184，说明该模型算法有较高的可重复性和预测性。

在软件中将VIP值标准调整到1.70，筛选特征化学位移段（单位：ppm）。0～1.00 ppm化学位移段1个：0.96；2.02～3.00 ppm段9个：2.04、2.12、2.16、2.36、2.40、2.48、2.52、2.80、3.00；3.02～4.00 ppm段3个：3.24、3.76、3.92；4.00～6.00 ppm段2个：4.28、6.50。通过独立样本t检验，确定6个有统计学意义的信号化学位移段：2.04 ppm、2.12 ppm、3.00 ppm、3.24 ppm、3.76 ppm、6.50 ppm。通过人类代谢数据库（http：//www.hmdb.ca/），设置在上述特征位移段±0.02 ppm查询代谢产物，发现14种最能反映与对照组区别的小分子代谢产物（表4）。

2.3代谢特征分析

通过查阅KEGG代谢通路数据库，进一步分析以上小分子物质所位于的代谢路径。课题组进行最后分析，确定了不随意运动型脑瘫患儿的异常特征代谢，表明在脑瘫患儿中牛磺酸代谢通路、三羧酸循环活动下降，而谷氨酸代谢通路上升。见图2。

表1　不随意运动型脑瘫患儿性别、年龄、病因及MRI

表2　患儿步态及语言基本临床表现

表3　两组一般资料比较

图1　偏最小二乘法模型得分图

表4　根据VIP值及代谢数据库确定相关性高的小分子物质

图2　不随意运动型脑瘫代谢异常扰动图

3　讨论

在以往众多研究中，都有证据表明脑瘫患儿与正常儿童机体代谢有着显著差异。脑瘫患儿常生长发育迟缓，在粗大运动功能分级重度到极重度的患儿中，发现骨密度较正常儿童明显降低［15］；另外，肌纤维和Ⅰ型胶原蛋白会在脑瘫患儿肌细胞内过量堆积，也造成肌细胞的不可逆损害和粗大运动功能的提升受限［16］；除了在运动系统和神经系统，脑瘫患儿在呼吸系统、消化系统等也存在不同程度的缺陷［17］。本实验纳入的不随意运动型脑瘫患儿BMI低于对照组，说明患儿在脑瘫致病条件下，全身骨骼肌肉不自主收缩，加重消耗，也可对消化功能及生长发育产生一定影响。更加说明作为临床医生及康复医生，应将患儿作为一个整体，全面看待其身体功能转归及代谢变化。虽然国内也曾有报道对类似的运动障碍、肌张力障碍疾病的代谢组学研究，但还没有针对不随意运动型脑瘫患儿的报道，也没有较明确的代谢网络异常通道比较分析［14］。

本研究发现，牛磺酸、谷氨酰胺和能量代谢通路扰动异常在患儿体内有意义，其中牛磺酸代谢通路扰动明显。人体内含有大量牛磺酸。它不仅仅是作为一种必需能量物质，参与机体的生长代谢，而且还能够参与维持机体的免疫功能，调节全身多系统正常工作。已有研究发现牛磺酸通路代谢异常与许多运动障碍性疾病有关。有研究表明，在舞蹈病大鼠中，脑组织中多个区域的牛磺酸含量下降［18］，给予牛磺酸治疗后，相关酶活性上调，患病大鼠的运动能力明显提高［19］。在帕金森病患者脑脊液中，牛磺酸含量降低，给予立体定向高频电刺激手术后，在运动能力改善的患者中发现，壳核和尾状核中牛磺酸含量较术前升高［20］。一系列研究显示，牛磺酸通过减弱氧化反应途径，抵抗凋亡，稳定细胞膜通透性，来保护线粒体和内质网［21］。本实验发现的牛磺酸代谢异常，如果在不随意运动型脑瘫患儿中具有普遍性，干预牛磺酸代谢有可能成为治疗脑瘫的新方向。

谷氨酰胺含量升高及其代谢通路异常，是本实验另一发现。在缺血缺氧体外模型中，随着损伤的加重，谷氨酰胺也释放增多［22］。谷氨酸酰胺的兴奋性毒性也被证明与许多神经退化性疾病相关。例如在多发性硬化患者中，过度的谷氨酰胺释放，导致其离子型和代谢型受体活性升高，加速细胞浆内的Ca2+堆积而后加速细胞凋亡［23］。谷氨酰胺代谢通路在不随意运动型脑瘫患儿中上升也进一步印证其作为兴奋性毒性产物对患儿的损害。

在本研究中，患儿血清三羧酸能量循环减弱也是另一重要发现。三羧酸循环不仅是人体内能量代谢的中心，也是糖、蛋白质、脂类三大物质代谢的枢纽。在本研究中发现柠檬酸、延胡索酸、丁酮二酸等循环网络中重要物质含量下降，一方面可能与脑瘫患儿产生能量物质能力下降或循环路径不畅有关；另一方面也可能是由于患儿消耗增加所致。三羧酸代谢异常也会导致一系列运动障碍疾病。延胡索酸缺乏症是一种在胎儿期极其少见的常染色体隐性遗传病，可导致不随意运动、癫痫等［24］。而通过口服二甲基延胡索酸，可以作为治疗多发性硬化的方法之一［25］。

虽然纳入患儿都应被归为不随意运动型脑瘫，但病因包括出生后黄疸、产时缺氧、产后脑出血和高热惊厥，且脑损伤部位、临床表现并不完全相同。本研究样本量偏少，组内患儿身体状态、脑损伤程度、临床表现等具有一定差异。今后的工作将继续收集相关的病例资料，分析相关影响因素，利用代谢组学方法，结合其他分子学方法，定量分析本研究得出的通路上扰动代谢产物上下游关系。

综上所述，本实验利用代谢组学方法研究不随意运动型脑瘫患儿内环境，发现包括牛磺酸代谢通路、谷氨酰胺代谢通路及能量代谢通路异常，为病理生理机制研究打下基础。

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Metabolic Profile of Dyskinetic Cerebral Palsy Based on Metabonomics

CHEN Jun-chen1，2，HE Xia2，DUAN Yu2，PENG Yun-chuan2，ZHANG Ming-wei1
1.Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；2.Sichuan Rehabilitation Hospital，Chengdu，Sichuan 611135，China
Correspondence to ZHANG Ming-wei.E-mail：drcc82@163.com

Objective To analyze the metabolic profile of children with dyskinetic cerebral palsy by metabolomics，and its abnormal metabolic pathway.Methods The serum of 10 children with dyskinetic cerebral palsy（patient group）and 7 healthy children（control group）aged 6 to 12 years were collected at clinic from May to August，2014.The serum samples were tested by the nuclear magnetic resonance spectrometer and the spectroscopies were discriminated by partial least squares-discriminant analysis.According to the human metabolome database，the final metabolites disturbed would be figured out.Results 15 chemical shifts were defined，and 6 of them，including 2.04 ppm，2.12 ppm，3.00 ppm，3.24 ppm，3.76 ppm，6.50 ppm，were significantly different between 2 groups（P＜0.05）.The KEGG Pathway Database showed that the levels of taurine，fumarate，oxaloacete，pyruvate，citrate，aspartate，succinate，malate，cysteine decreased，and the levels of glutamate，2-oxoglutarate，glutamine，leucine，alanine increased.The abnormal metabolism was found in taurine metabolism，glutamine metabolism and energy metabolism pathways.Conclusion Based on metabolomics，the metabolic profile of children with dyskinetic cerebral palsy was discriminated out successfully.The further research can focus on the small molecules found out.

cerebral palsy；dyskinetia；metabolomics；nuclear magnetic resonance spectroscopy；partial least square discriminant analysis

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.016

R742.3

A

1006-9771（2016）04-0448-07

（2015-09-27

2015-10-28）