TOX与Notch1在MF中的表达

赵　晶　张福仁　王建文　陈声利　周桂芝　刘永霞　陈学超　卢宪梅

TOX与Notch1在MF中的表达

赵晶1，2张福仁2王建文2陈声利2周桂芝2刘永霞2陈学超2卢宪梅2

目的： 检测TOX蛋白及活化型Notch1蛋白在MF中的表达，探讨TOX及Notch1蛋白作为MF分子标记物的可行性。方法： 采用免疫组化方法检测35例MF（15例斑片期，10例斑块期，10例肿瘤期）和45例对照组（15例淋巴瘤样丘疹病、15例扁平苔藓、15例银屑病）的病理组织标本中TOX蛋白及活化型Notch1蛋白的表达。结果： TOX蛋白染色结果:MF阳性率约94.3%，且阴性标本全部为斑片期，对照组阳性率75.6%。MF组TOX蛋白表达强度高于对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。MF组与对照组所有病例肿瘤细胞Notch1阴性。结论： MF组与对照组TOX蛋白表达水平有显著性差异，但还不足以证明TOX可作为诊断MF的分子标记物，需进一步验证。Notch1蛋白不在皮肤T细胞淋巴瘤中表达，故无法作为MF的分子标记物。

皮肤T细胞淋巴瘤； 蕈样肉芽肿； TOX； Notch信号通路； Notch1

蕈样肉芽肿（mycosis fungoides，MF）是原发性皮肤淋巴瘤中最常见的类型。早期 MF（early mycosis fungoides，eMF）的诊断至今仍是皮肤科的一个难题，其临床及病理表现常常类似于良性炎症性皮肤病，而且缺乏特异的分子标记物。

2012年首次提出TOX（thymocyte selection-associated high mobility group box）基因，即胸腺细胞选择相关高迁移率族基因，可以作为 MF的分子标记物［1］。TOX在 MF进程中所起的作用也有相关研究［2，3］。此后又有一些学者对TOX在MF中的表达进行了不同的试验及验证，但是样本量及对照样本种类都有所限制，故本实验扩大实验组与对照组的样本量进行进一步的验证研究，以期发现TOX在MF各阶段以及其它皮肤疾病中的表达是否有显著性差异。国内刘洁团队采用免疫组化、RNA提取及RT-PCR、Western blot、细胞培养及转染、细胞迁移及入侵检测等技术，最终提出TOX在MF皮损中高表达，且与MF的增殖及转移相关，TOX是MF的一个诊断标记，并在疾病进展过程中具有病因学作用［2］。

Notch信号通路无第二信使，是一种构造比较简单的通路，迄今为止，已经有不少学者证实Notch通路与很多肿瘤的发生发展有重要关系，至今发现的Notch受体有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，而其中在肿瘤组织中Notch1受体通路异常报道最多。有研究表明，Notch1在淋巴细胞发育过程中发挥着重要作用，而且已有学者证实Notch1在T细胞淋巴瘤中的异常表达，但是至今没有在皮肤T细胞淋巴瘤中的相关研究［4，5］，故本研究主要针对皮肤T细胞淋巴瘤中最常见的MF，进行Notch1蛋白表达的检测，分析活化型Notch1（NICD）在MF中的表达是否有特异性。

1　资料与方法

1.1研究对象 MF组及对照组均来自我院2011-2015年的病例，共80例，其中MF组患者35例（斑片期15例，斑块期10例，肿瘤期10例），对照组包括淋巴瘤样丘疹病15例、扁平苔癣15例、寻常型银屑病15例。所有病理标本蜡块均来自于我院病理科。

1.2主要仪器及试剂 主要仪器包括:徕卡公司切片机RM2235、全自动染色机ST5020、全自动免疫组化机BOND-MAX、封片机CV5030，湖北康强医疗器械公司摊片烤片机TKD-TK。一抗:兔抗人多克隆TOX抗体，购自SIGAM公司；兔抗人多克隆Notch1抗体，Notch胞内段（NICD），购自MILLIPORE公司。二抗:二抗试剂盒，购自徕卡公司自动免疫组化机配套试剂盒。

1.3实验方法

1.3.1预实验 分别将TOX抗体及活化型Notch1抗体稀释不同浓度（1∶500，1∶300，1∶200，1∶100，1∶50），观察染色效果，找到最适稀释浓度。最终确定TOX及Notch1最适稀释度均为1∶100。

1.3.2免疫组化检测TOX及Notch1在实验组及对照组的表达 组织蜡块切片机切片，摊片，并置于75℃烤片机上烤30 min。将切片置于全自动染色机中脱蜡，顺序依次为:二甲苯A 5 min，二甲苯B 5 min，无水乙醇A 5 min，无水乙醇B 5 min，95%乙醇1 min，85%乙醇1 min，75%乙醇1 min，自来水2 min。

在全自动免疫组化机系统中添加病例，每个编号添加TOX及Notch1两个玻片，并打印粘贴标签。将玻片依次放在卡槽上，按标识将干净的盖板放置在玻片上，所有玻片放置完毕后，将玻片架保持水平轻轻推入仪器中，点击装载/卸载按钮。

将TOX/Notch1抗体与稀释液按1∶100稀释度注入试剂瓶扫描条码并录入抗体信息。将一抗及二抗试剂盒置于试剂架上，系统自行检查玻片、试剂、仪器均正常后，点击运行按钮。机器开始运行。染色结束后，取下玻片架及盖板，并清洗盖板。将染色完成的玻片置于全自动染色机中脱水。脱水完成后切片放入自动封片机封片。

1.4病理科医师阅片、评分 每个切片由两名皮肤病理专业医师阅片，评分由阳性细胞计数以及染色强度共同决定。

结果判定标准:40×10视野随机观察10个视野，各计数100个细胞，阴性为0分，1～25%为1分，26～50%为2分，51～75%为3分，76～100%为4分。

染色强度标准:不着色为0分，浅棕黄为1分，金黄/棕黄为2分，棕褐色为3分。

蛋白表达水平由计数×染色强度，0分为-，1～3分为+，4～6分为++，7～9分为+++，10～12分为++++。

2　结果

免疫组化结果（MF均显示分期，LyP:淋巴瘤样丘疹病，LP:扁平苔藓，诊断均经过2位病理科医师确诊）结果均按照蛋白表达水平显示（蛋白表达水平=计数×染色强度）。

2.1TOX蛋白染色结果 实验组:35例MF中有33例TOX阳性，2例阴性，且2例阴性全部为斑片期；15例斑片期MF中2例阴性，10例+，3例++；10例斑块期中6例+，2例++，2例+++；10例肿瘤期中4例+，4例++，2例++++（图1，图2）。对照组:15例淋巴瘤样丘疹病中6例阴性，8例+，1例++；15例银屑病中5例阴性，8例+，2例++；15例扁平苔癣13例+，2例++（图3）。

2.2活化型Notch1蛋白染色结果 所有病例中仅有4例表达阳性（+），且均表现为中性粒细胞阳性，并非是肿瘤细胞。4例分别为1例MF肿瘤期，2例淋巴瘤样丘疹病，1例银屑病（图4）。

对TOX蛋白表达强度采用Fisher’s exct test，MF组与对照组比较（MF组阴性表达2例，阳性33例；对照组阴性表达11例，阳性34例），P=0.0074（P＜0.05），差异有统计学意义（所有数据经SPSS 17.0进行统计和处理）。

图1　肿瘤期MF标本中TOX蛋白的表达

图2　斑片期MF标本中TOX蛋白的表达

图3　对照组中TOX蛋白的表达

图4　4a活化型Notch1蛋白在汗腺表达阳性（×200）；4b活化型Notch1蛋白在中性粒细胞表达阳性（×200）；4c活化型Notch1蛋白在MF肿瘤细胞中不表达（×200）

3　讨论

皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是一种表现在皮肤的一种特殊类型的T细胞淋巴瘤，早期的CTCL在临床与组织病理表现上与良性炎症性皮肤病很难区分，早期诊断比较困难［7］，这其中又以eMF为研究热点。

eMF（斑片期及早期斑块期）诊断困难主要是因为缺乏特异性细胞及分子标记物。Zhang等采用高通量基因组转录分析筛选出349个基因，在eMF与正常皮肤中存在差异性表达，后又在其中发现只有19个基因是在eMF中特异表达，在炎症性皮肤病中无特异性［1］。其中TOX和PDCD1，在RNA表达上与炎症性皮肤病比较有明显不同，而且对eMF皮损行免疫组化及免疫荧光染色MF细胞以及Pautrier’s微脓肿中均有TOX特异性染色表现，于是进而提出TOX可作为MF分子标记物［1］。2014年其团队又进一步对113例MF标本进行了TOX表达水平的检测，最终发现TOX mRNA的表达水平显著增高于慢性炎症性疾病及正常皮肤组织，且MF斑块期、肿瘤期的表达水平高于斑片期。另外指出TOX的表达水平与疾病进程及预后有相关性，从而提出TOX mRNA的表达可作为对MF诊断及预后有用的一个标记［8］。

随后，Morimura等提出TOX是否可以作为不同亚型皮肤淋巴瘤肿瘤细胞的标记物。他们采用免疫组化方法检测了TOX在MF（斑片期、斑块期、肿瘤期）、SS、淋巴瘤样丘疹病（LyP）、间变性大细胞型原发性皮肤淋巴瘤（PCALCL）、成人 T细胞淋巴瘤（ATLL）、外周T细胞淋巴瘤（PTCL）以及未分类型（NOS），同时检测了特应性皮炎（AD）及正常皮肤组织作为对照组。另外检测了MF/SS的mRNA表达水平。免疫组化结果显示TOX在MF、SS、PTCL、NOS中高表达（明显的核着色），在LyP、PCALCL、ATLL中显示核轻微着色。TOX mRNA在SS中的表达高于在MF中的表达。由此提出结论:TOX可能成为某些特定类型的皮肤淋巴瘤的肿瘤细胞的特殊标记物［7］。

本研究主要从蛋白表达水平来探究TOX能否作为MF的特异性分子标记物，结果显示MF组与对照组均有阳性表达，在MF中，随病程进展，表达增强（斑片期最高强度为++，斑块期为+++，肿瘤期为++++），且阴性标本均为斑片期。作为一种低度恶性的T细胞淋巴瘤，淋巴瘤样丘疹病也有TOX表达，但蛋白表达强度较MF低。银屑病及扁平苔癣作为炎症性皮肤病，均有表达，蛋白表达强度较MF低。统计学结果显示MF与对照组蛋白表达水平有显著性差异，但若把TOX作为诊断MF的分子标记物，或者早期MF与炎症性皮肤病的鉴别诊断标记物，本实验结果还不足以提供可靠证据，可能还需进一步验证。

Notch信号通路被证实与很多肿瘤的发生发展有关，在卵巢癌、肝癌、肾细胞癌等肿瘤中均发现过Notch的异常表达。Notch蛋白影响调控了血液及淋巴系统的部分功能，有学者发现哺乳动物中Notch1在胸腺中高表达，且在成人T细胞淋巴瘤中有突变的发生，并验证了Notch1在T细胞的分化阶段中起一定作用［4，9，10］。Notch1基因编码的Notch1蛋白是一种跨膜的蛋白受体，分为胞外段、跨膜区及胞内段三部分，其中胞内段即为 NICD。近年有很多学者对Notch1通路与成人T细胞白血病之间的关系进行了多方面的研究，有实验证实了在急性T细胞白血病中Notch1基因有突变，后来相继对其他T细胞淋巴瘤中的Notch1表达做了研究，发现有异常表达。

以上研究均针对血液系统T细胞淋巴瘤，并没有对皮肤T细胞淋巴瘤的相关研究［5，11-13］。我们的研究结果显示MF组及对照组均未发现表达Notch1蛋白的T细胞，仅有4例中性粒细胞表达Notch1。故本实验中Notch1蛋白并不在皮肤T细胞淋巴瘤中表达，推测Notch信号通路可能不参与MF的发病机制，进一步结论还需更深入的实验研究。

［1］Zhang Y，Wang Y，Yu R，et al.Molecular markers of earlystage mycosis fungoides［J］.J Invest Dermatol，2012，132（6）:1698-706.

［2］Yu X，Luo Y，Liu J，et al.TOX acts an oncological role in mycosis fungoides［J］.PLoS One，2015，10（3）:e0117479.

［3］Litvinov IV，Netchiporouk E，Cordeiro B，et al.The Use of Transcriptional Profiling to Improve Personalized Diagnosis and Management of Cutaneous T-cell Lymphoma（CTCL）［J］.Clin Cancer Res，2015，21（12）:2820-2829.

［4］Kuksin CA，Minter LM.The link between autoimmunity and lymphoma:does NOTCH signaling play a contributing role？［J］.Front Oncol，2015，5:51.

［5］Jundt F，Anagnostopoulos I，Förster R，et al.Activaed Notch1 signaling promotes tumor cell proliferation and survival in Hodgkin and anaplastic large cell lymphoma［J］. Blood，2002，99（9）:3398-3403.

［6］El Shabrawi-Caelen L，Kerl H，Cerroni L，et al.Lymphomatoid papulosis:reappraisal of clinicopathologic presentation and classification into subtypes A，B，and C［J］.Arch Dermatol，2004，140（4）:441-447.

［7］Morimura S，Sugaya M，Suga H，et al.TOX expression in different subtypes of cutaneous lymphoma［J］.Arch Dermatol Res，2014，306（9）:843-849.

［8］Huang Y，Litvinov IV，Wang Y，et al.Thymocyte selectionassociated high mobility group box gene（TOX）is aberrantly over-expressed in mycosis fungoides and correlates with poor prognosis［J］.Oncotarget，2014，30；5（12）:4418-4425.

［9］Hasserjian RP，Aster JC，Davi F，et al.Modulated expression of notch1 during thymocyte development［J］.Blood，1996，88（3）:970-976.

［10］Kadesch T.Notch signaling:the demise of elegant simplicity［J］.Curr Opin Genet Dev，2004，4（5）:506-512.

［11］Logeat F，Bessia C，Brou C，et al.The Notch 1 receptor is cleaved constitutively by a furin-like convertase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（14）:8108-8112.

［12］Baumgartner AK，Zettle A，Chott A，et al.High frequency of genetic aberrations in enteropathy-type T-cell lymphoma［J］.Lab Invest，2003，83（10）:1509-1516.

［13］Cejkova P，Zettl A，Baumgärtner AK，et al.Amplification of NOTCH1 and ABL1 gene loci is a frequent aberration in enteropathy-type T-cell lymphoma［J］.Virchows Arch，2005，446（4）:416-420.

（收稿:2016-01-19 修回:2016-01-20）

TOX and Notch1 exPression in mycosis fungoides

ZHAO Jing1，2，ZHANG Furen2，WANG Jianwen2，CHEN Shengli2，ZHOU Guizhi2，LIU Yongxia2，CHEN Xuechao2，LU Xianmei2.

1.School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China；2.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，Jinan 250022，China Corresponding author:LU Xianmei，E-mail:xinmeilu2013@163.com

Objective:To detect the expression of TOX and Notch1 protein for mycosis fungoides（MF）and to determine the role as a potential molecular markers for MF.Methods:TOX and Notch1 protein were detected by immunohistochemical staining in the lesions of 35 patients with MF（15 patients at patch stage，10 at plaque stage and 10 at tumour stage）and in 45 controls（15 patients with lymphomatoid papulosis，15 with lichen planus and 15 with psoriasis）.Results:The positivity rate of TOX in the patients with MF was 94.3% and 76%in controls.The level of TOX protein expression was higher in MF patients than in controls（P＜0.05）.Notch1 protein was negative in tumor cells of all MF patients and controls.Conclusion:Although TOX expression level was higher in MF patients，TOX protein can not be used as a potential molecular marker for MF and further experimental studies should be performed.Notch1 protein is not a molecular marker for MF.

cutaneous T-cell lymphomas；MF；TOX；Notch signaling pathways；Notch1

1济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南，250000
2山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022

卢宪梅，E-mail:xinmeilu2013@163.com

因早期MF（eMF）临床及病理表现与良性炎症性皮肤病常常难以鉴别，故本实验选择具有典型病理表现的扁平苔藓及银屑病作为对照组；淋巴瘤样丘疹病（LyP）与MF很难区分［6］，为了比较广泛的验证TOX及Notch1是否是MF特异性的分子标记物，故也把淋巴瘤样丘疹病作为对照组。