杨梅黄酮对人成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

谢　璟　郑炎焱

杨梅黄酮对人成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

谢璟郑炎焱

目的： 明确杨梅黄酮对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。方法： 原代培养的人皮肤成纤维细胞加入不同浓度（0，10，25，50，75，100 μM）的杨梅黄酮，流式细胞仪检测细胞周期，MTT检测细胞增殖活性和胶原合成。结果： 杨梅黄酮浓度为10 μM及25 μM时成纤维细胞增殖活性明显增加；浓度高于50 μM处理后的成纤维细胞增殖活性降低，I型胶原表达减少。结论： 杨梅黄酮大于50 μM时能抑制成纤维细胞胶原合成，提示该药具有较好的抗皮肤和内脏器官纤维化作用，为治疗纤维化相关疾病提供了一定的理论依据。

成纤维细胞；杨梅黄酮；胶原

杨梅黄酮广泛存在于杨梅中，杨梅素（myricetin，Myr）化学名称为3，5，7，3'，4'，5'-六羟基黄酮，是黄酮类化合物。广泛存在于双子叶植物，特别是一些木本植物的花和叶中，溶于甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿、石油醚，近年来发现其具有抗肿瘤、抗氧化、防止血小板聚集等多种生物活性［1，2］。有研究表明黄酮类药物能依赖性地抑制细胞内胶原合成，表明其在体外也有抗纤维化作用［3］，可为抗纤维化药物研究提供理论依据。本研究结合纤维化的病理生理机制，从细胞及分子水平重点研究杨梅黄酮对人皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，以寻找治疗增生性瘢痕等纤维化相关疾病的有效药物。

1　材料和方法

1.1主要试剂和仪器 杨梅黄酮购自杭州和田生物技术有限公司，纯度＞98%，将其用DMSO溶解，-20℃避光保存；二甲基亚砜（sigma公司）；MTT（sigma公司）；羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；人I型胶原试剂盒（美国Uscnlife公司）；ELITEESP流式细胞仪（Beckman公司）；DU-800型紫外分光光度计（美国Beckman公司）；PI染液（美国Beckman Coulter公司）。

1.2方法

1.2.1原代成纤维细胞的培养 材料取自健康男子包皮环切术切除的包皮，用组织块法进行原代培养，实验用第3～5代［4］。

1.2.2改良MTT比色法检测细胞增殖和细胞毒性用不同浓度杨梅黄酮组（0，10，25，50，75，100 μM），处理人皮肤成纤维细胞24 h、48 h、72 h后，向每孔加入MTT溶液10 μL，选择490 nm波长，在自动酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收（A）值。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.2.3杨梅黄酮对人皮肤成纤维细胞（HSF）培养液中羟脯氨酸含量影响的测定 将人皮肤成纤维细胞（HSF）以5×107/L的细胞密度接种于24孔细胞培养板，每孔体积 1 mL，加入含不同浓度杨梅黄酮的DMEM培养液，每个试剂浓度测4个孔，加药后48 h，从每个孔里各吸取 0.5 mL培养基，按羟脯氨酸（HPR）检测试剂盒说明书方法操作，在酶标仪490 nm处检测A值，样品中羟脯氨酸质量浓度（μg/mL）=测定管A值×标准管浓度/标准液A值。

1.2.4对人皮肤成纤维细胞培养液中I型胶原蛋白影响的测定 取细胞培养上清液，按I型胶原检测试剂盒说明书方法操作，在酶标仪450 nm处检测得到I型胶原含量。

1.2.5杨梅黄酮对人皮肤成纤维细胞细胞周期影响的检测 取第3～7代人皮肤成纤维细胞，以1×108/L的密度接种于直径25 cm培养瓶中，待细胞长至60%～70%融合时，加入杨梅黄酮浓度分别为0，10，25，50，75，100 μM含10%胎牛血清的DMEM培养基，每个浓度2瓶细胞，继续培养48 h，消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期。

1.3统计方法 全部资料用SPSS 17.0统计软件录入和统计分析。正态分布资料用¯x±s表示；对于重复测量的MTT值，采用重复测量资料的方差分析；对于人I型胶原蛋白测定值、羟脯氨酸值的分析，采用随机区组设计资料的方差分析；当多个总体均数不全相同时，采用SNK法或LSD法进行多个样本均数的两两比较。

2　结果

2.1不同浓度杨梅黄酮处理24 h、48 h、72 h后测量MTT值 应用MTT比色法测定人皮肤成纤维细胞增殖活力，结果见表1。与空白对照组相比，杨梅黄酮浓度为10，25 μM时人皮肤成纤维细胞增殖活力增加，浓度大于50 μM杨梅黄酮作用后人皮肤成纤维细胞增殖活力降低，差别具有非常显著性意义（P＜0.01）。

表1　不同浓度杨梅黄酮处理后MTT值测定结果

表1　不同浓度杨梅黄酮处理后MTT值测定结果

加药浓度（μM）　n　　不同时间的MTT值24 h　48 h　72 h 0　6　0.261±0.009　0.354±0.012　0.539±0.010 10　6　0.287±0.006　0.394±0.008　0.576±0.005 25　6　0.312±0.010　0.402±0.009　0.612±0.007 50　6　0.235±0.008　0.216±0.010　0.189±0.008 75　6　0.193±0.010　0.132±0.009　0.107±0.007 100　6　0.083±0.010　0.052±0.009　0.030±0.007

2.2I型胶原蛋白测定值分析 对不同浓度杨梅黄酮作用48 h后成纤维细胞培养液中人I型胶原蛋白测定值进行方差分析。A、B、C三孔测定值的差异无统计学意义（F区组=1.815，P=0.213），不同浓度杨梅黄酮作用48 h后成纤维细胞培养液中人I型胶原蛋白测定值的差异有统计学意义（F=539.848，P＜0.001），且各处理组两两之间的差异均有统计学意义（SNK法，P＜0.05），其人I型胶原蛋白测定值随杨梅黄酮加药浓度（大于50 μM时）升高而逐渐变小（表2）。

2.3不同浓度杨梅黄酮作用48 h后成纤维细胞羟脯氨酸含量影响的方差分析 不同浓度杨梅黄酮对羟脯氨酸含量影响有统计学意义（F处理=379.711，P＜0.001），且各处理组两两之间的差异均有统计学意义（SNK法，P＜0.05）。在杨梅黄酮浓度大于50 μM时，羟脯氨酸含量随杨梅黄酮加药浓度升高而逐渐减少（表3）。

表2　I型胶原蛋白测定值

表2　I型胶原蛋白测定值

药物　不同加药浓度I型胶原蛋白测定值0 μM　10 μM　25 μM　50 μM　75 μM　100 μM杨梅黄酮　2.9625±0.0328　3.1026±0.0602　3.2737±0.0146　1.8638±0.0413　1.6532±0.0180　0.5772±0.1375

表3　杨梅黄酮作用后成纤维细胞培养液中羟脯氨酸含量测定值

表3　杨梅黄酮作用后成纤维细胞培养液中羟脯氨酸含量测定值

药物　　不同杨梅黄酮浓度中羟脯氨酸含量0 μM　10 μM　25 μM　50 μM　75 μM　100 μM杨梅黄酮　53.42±1.43　55.16±1.43　59.14±1.85　28.28±1.63　21.72±1.14　7.71±1.43

2.4杨梅黄酮对人皮肤成纤维细胞细胞周期的影响

用流式细胞仪分别测定0，50，75，100 μM杨梅黄酮作用48 h后成纤维细胞的细胞周期及各期所占的百分比，可以看出，浓度大于50 μM时随着杨梅黄酮药物浓度的增加，G/G期细胞数量增加，G/M期和S期细胞数量逐渐减少，细胞增殖指数（PI）逐渐减小（表4）。

表4　成纤维细胞的细胞周期各期所占百分比

3　讨论

纤维化（fibrosis）可发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命［5］。虽然组织纤维化诱发因素多样、发生器官不同、临床表现各异，但是它们的发生和发展都是因为组织损伤后组织修复过程失调或更直接地说是组织修复反应过度的结果。这些过度修复包括成纤维细胞的激活增殖及细胞外间质（ECM）-如胶原蛋白、蛋白多糖等成分过度的沉积等现象［6］。皮肤组织的纤维化可见于增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（HKF），二者均是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理现象，其病理本质是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖和以胶原为主的细胞基质过度沉积，其中胶原主要由成纤维细胞合成分泌产生，因此后者的数量和功能状态在很大程度上决定了增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（HKF）纤维化的程度［7］，通过调控成纤维细胞（FB）凋亡有望成为有效防治病理性瘢痕的新亮点。本实验采用不同浓度的杨梅黄酮，观察杨梅黄酮对人皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，以寻找治疗人增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的有效药物。

黄酮类天然产物是近年来天然药物和人类健康产品研究开发的热点，从药用植物和经济植物中开发生理活性黄酮成分作为天然药物和保健品的原料已日益引起重视。杨梅为我国特产资源，鉴于地区差异，目前国际上对杨梅的研究刚刚起步，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、消除体内自由基等多种药理活性［8-11］。杨梅属植物在我国分布较广，不同种的不同部位均有入药，其抗肿瘤、抗氧化活性研究较多，并取得了一些良好的成果，为杨梅黄酮抗纤维化研究提供理论依据。本研究结合纤维化的病理生理机制，从细胞及分子水平重点观察杨梅黄酮抗成纤维细胞胶原合成作用。结果表明，杨梅黄酮在高浓度时可通过抑制成纤维细胞羟脯氨酸分泌，进而使细胞I型胶原蛋白的合成下降来干预纤维化进程；另外，高浓度杨梅黄酮还可通过影响人皮肤成纤维细胞周期，抑制静止状态的G1期细胞向S期转变，使DNA合成量减少，从而抑制细胞的增殖。而在本实验中，我们还发现杨梅黄酮在低浓度时对成纤维细胞生长反而具有促进作用，可能与其抗氧化作用有关，具体机制有待进一步研究。

上述实验说明杨梅黄酮在一定浓度范围内能抑制成纤维细胞胶原合成，提示该药具有较好的的抗皮肤和内脏器官纤维化作用，为其治疗纤维化相关疾病提供了一定的理论依据。

［1］Gutiérrez-Venegas G，Alonso Luna O，JA Ventura-Arroyo，et al.Myricetin suppresses lipoteichoic acid-induced Interleukin-1b and cyclooxygenase-2 expression in human gingival fibroblasts［J］.Microbiol Immunol，2013，57（12）:849-856.

［2］Zhang XH，ChenSY，Tang L，et al.Myricetin induces apoptosis in HepG2 cells through AKt/p70S6K/Bad signaling and mitochondrial apoptotic pathway［J］.Anticancer Agents Med Chemy，2013，13:1575-1581.

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［5］李才.器官纤维化基础与临床［M］，北京:人民卫生出版社，2003.3-7.

［6］Franklin TJ.Current approches to the therapy of fibrotic diseases［J］.Biohem Pharmacol，1995，49（3）:267-273.

［7］刘剑毅，李世荣，纪淑兴，等.三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的作用［J］.第三军医大学学报，2003，25（17）:1562-1563.

［8］KoCH，Shen SC，Hsu CS，et al.Mitochondrial-dependent，reactive oxygen species-independent apoptosis by myricetin: roles of protein kinase C，cytochrome c，and caspase cascade［J］.Biochem Pharmacol，2005，69（6）:913-927.

［9］Gutiérrez-Venegas G，Alonso Luna O，Ventura-Arroyo JA，et al.Myricetin suppresses lipoteichoic acid-induced interleukin-1β and cyclooxygenase-2 expression in human gingival fibroblasts［J］.Microbiol Immunol，2013，57（12）:849-856.

［10］Liu FT，Agrawal SG，Movasaghi Z，et al.Dietary flavonoids inhibit the anticancer effects of the proteasome inhibitor bortezomib［J］.Blood，2008，112（9）:3835-3846.

［11］Gutiérrez-Venegas G，Luna OA，Arreguín-Cano JA，et al. Myricetin blocks lipoteichoic acid-induced COX-2 expression in human gingival fibroblasts［J］.Cell Mol Biol Lett，2014，19（1）:126-139.

（收稿:2015-11-25 修回:2015-12-12）

Effect of myricetin on Proliferation and collagen synthesis of human fibroblasts

XIE Jing，ZHENG Yanyan.

Wenzhou People's Hospital，Wenzhou 325000，China

Objective:To determine the effect of myricetin on cell proliferation and collagen synthesis of human fibroblast.Methods:The primary cultured fibroblasts in vitro were isolated and treated with myricetin in different concentration（0，10，25，50，75，100 μM）.Cell cycle was measured by flow cytometry.The fibroblasts proliferation and the expression of collagen type I was assessed by MTT assay.Results:The cellular viability of fibroblast was increased in the dose of 10 μM and 25 μM of myricetin，and was decreased in the dose of 50 μM or above.Conclusion:The proliferation and collagen synthesis of human fibroblast can be inhibited when the concentration of myricetin is higher than 50 μM，which provides a theoretical base for the treatment of fibrosis diseases.

fibroblast；myricetin；collagen

温州市科技计划项目（编号:2014S0053）

浙江省温州市人民医院，325000