壳寡糖阿胶制剂的毒理学研究

周晓琳，卢连华,郭婕,谢玮,颜燕, 程东,杨非,姚文环

(1山东省精神卫生中心,济南250014；2山东省疾病预防控制中心)



壳寡糖阿胶制剂的毒理学研究

周晓琳1，卢连华2,郭婕2,谢玮2,颜燕2, 程东2,杨非2,姚文环2

(1山东省精神卫生中心,济南250014；2山东省疾病预防控制中心)

目的研究壳寡糖阿胶制剂的毒性。方法 采用小鼠急性毒性试验检验壳寡糖阿胶制剂的急性毒性，采用鼠伤寒沙门菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验检测壳寡糖阿胶制剂的遗传毒性，采用大鼠30 d喂养试验检测壳寡糖阿胶制剂的亚急性毒性。结果 急性毒性试验结果显示，壳寡糖阿胶制剂属无毒级物质。Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性，说明壳寡糖阿胶制剂无遗传毒性。大鼠30 d喂养试验结果显示，该样品30 d喂养未见大鼠亚急性毒性作用。结论 壳寡糖阿胶制剂为无毒物质，无急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性。

壳寡糖；阿胶；急性毒性试验；遗传毒性试验；亚急性毒性试验;大鼠

壳寡糖(又称寡聚氨基葡糖)由甲壳素脱乙酰的产物壳聚糖降解获得,是由2～10个氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖有广泛的生物学活性，可提高机体免疫力、抗菌抑菌、促进钙及其他矿物质的吸收、促进双歧杆菌等有益菌增殖[1～3]，有辅助降血糖、降血脂、抗氧化、促神经元生长、抑制肿瘤及延缓运动疲劳作用[4～7]。阿胶是由驴皮去毛后熬制而成,有补血止血、滋阴润肺之功。主治血虚证、虚劳咯血、吐血、尿血、便血、血痢、妊娠下血、崩漏、阴虚心烦失眠、肺虚燥咳、虚风内动之痉厥抽搐。卫生部2002年公布的51号文认定，阿胶既属于食品又属于药品。但有关壳寡糖阿胶制剂的毒理学研究未见报道。为确保其食用安全性，根据2003年版《保健食品检验与评价技术规范》[8]，2013年5～6月，我们对某壳寡糖阿胶制剂进行了急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性试验。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料壳寡糖阿胶制剂由某企业提供。SPF级ICR小鼠(小鼠急性毒性试验用)由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2009-0004；SPF级ICR小鼠(骨髓微核试验和精子畸形试验用)和SPF级 SD大鼠(大鼠30 d喂养试验用)由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2009-0004；饲养环境为屏障级，使用许可证号：SYXK(鲁)2013-0008，室温20～22 ℃，相对湿度45%～65%。实验动物标准饲料为北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2009-0008号。Ames试验标准菌株购于中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。S-9制剂由本实验室自制。敌克松购于Riedel-Haen公司，批号:45482；2-氨基芴购于美国Fluka Chemie AG公司,批号:252361689；1,8-二羟基蒽醌购于Merck Schuchardt公司，批号:7238243；二甲基亚砜购于上海试剂总厂，批号:20040101。

1.2壳寡糖阿胶制剂急性毒性观察采用急性毒性试验，按照最大耐受量(MTD)法进行。选择雌雄各10只SPF级ICR小鼠，体质量18.4～21.1 g。实验前动物空腹16 h(不限制饮水)。称取10.0 g受试物，以蒸馏水配至20 mL，终浓度为0.50 g/mL，分两次灌胃，间隔4 h，每次灌胃量为0.2 mL/10 g，累计染毒剂量为20.0 g/kg。连续观察14 d，记录动物的中毒表现及死亡情况。

1.3壳寡糖阿胶制剂遗传毒性观察

1.3.1鼠伤寒沙门菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)试验菌株为经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，体外活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆制备的S-9混合液。取受试物，分别以蒸馏水、二甲基亚砜(DMSO溶解)、95%乙醇、丙酮作溶剂，经过比较，该受试物在蒸馏水中溶解效果最好，故试验中选取蒸馏水作溶剂。根据毒性测定结果，设8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5个剂量，同时设立自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组。称取受试物5.00 g，置于容量瓶中，以蒸馏水作溶剂，定容至100 mL，用蒸汽消毒器于0.068 Mpa压力下处理20 min，冷却后取出放置4 ℃保存，浓度为50 000 μg/mL。取蒸馏水依次进行1∶4稀释，终浓度分别为10 000、2 000、400、80 μg/mL。每皿加入0.1 mL，受试物浓度分别相当于5 000、1 000、200、40、8 μg/皿。试验按照平板掺入法在加S-9与不加S-9混合液的条件下进行，每个组别设3个平皿。TA97不加S-9、TA98不加S-9所用阳性对照物为敌克松50 μg/皿，TA97加S-9、TA98加S-9、TA100加S-9所用阳性对照物为2-氨基芴10 μg/皿，TA100不加S-9、TA102不加S-9所用阳性对照物为甲基磺酸甲酯0.5 μg/皿，TA102加S-9所用阳性对照物为1，8-二羟基蒽醌50 μg/皿。所用溶剂均为二甲基亚砜溶液。若受试物的回变菌落数为自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量—效应关系则判定为阳性。整套试验在相同条件下重复做2次，取均值。

1.3.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验选择体质量25～30 g的SPF级ICR小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。3个试验组染毒剂量分别为2.5、5.0、10.0 g/kg，另设蒸馏水阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg)。分别称取2.5、5.0、10.0 g受试物，以蒸馏水配至20 mL，终浓度分别为0.125、0.250、0.500 g/mL，灌胃给予低、中、高剂量组实验动物，灌胃量为0.2 mL/10 g。各组动物灌胃共2次，间隔24 h，末次给予受试物后6 h处死动物，常规制片。每只动物镜检1 000个嗜多染红细胞(PCE)，记录微核细胞数，计算微核率(即微核细胞数/嗜多染红细胞数，以千分率表示)。

1.3.3小鼠精子畸形试验选择体质量27～29 g的雄性SPF级ICR小鼠25只，随机分为5组，每组5只。3个试验组染毒剂量分别为2.5、5.0、10.0 g/kg，另设蒸馏水阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg)。分别称取2.5、5.0、10.0 g受试物，以蒸馏水配至20 mL，终浓度分别为0.125、0.250、0.500 g/mL，灌胃给予低、中、高剂量组实验动物，灌胃量为0.20 mL/10 g，1次/d，连续5 d。首次灌胃后第35天处死动物，常规制片。每只动物计数1 000个结构完整的精子，记录畸变类型和数量，计算精子畸形率(以百分率表示)。

1.4壳寡糖阿胶制剂亚急性毒性观察采用大鼠30 d喂养试验。选用体质量70～90 g的断乳大鼠80只，随机分为4组，每组20只，雌雄各半。根据人体推荐量及最高受试物添加原则设低、中、高剂量3个实验组,受试物剂量分别为1.17、2.33、4.67 g/kg体质量(分别相当于人体推荐量的25、50、100倍)。将受试物按照动物体质量的10%计算食物摄入量掺入饲料中，即1.17%、2.33%、4.67%(质量分数)喂饲实验动物。对照组给予基础饲料。单笼喂养，自由饮食，连续观察30 d。实验末期禁食16 h，称取动物体质量后，经腹主动脉取血，进行血液学和生化指标测定，解剖动物并取材，现大体观察，然后对肝、肾、脾、胃、肠、卵巢、睾丸行病理学检查。

2　结果

2.1急性毒性灌胃给予受试物后，未见明显中毒症状。14 d内动物无死亡。最大耐受量试验结果显示，该受试物对两种性别小鼠的MTD均大于20.0 g/kg。根据急性毒性分级标准，该样品属无毒级。

2.2遗传毒性

2.2.1Ames试验两次Ames试验中受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,亦无剂量-效应关系 ,表明受试物剂量在8～5 000 μg/皿时对鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株无致突变性。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验各实验组微核率与阴性对照组差异无统计学意义，而阳性对照组与阴性对照组微核率相比P均<0.01。见表1。

表1　雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果

注：与阴性对照组比较，*P<0.01。

2.2.3小鼠精子畸形试验2.5 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg实验组及阴性对照组、阳性对照组小鼠精子畸形率分别为1.94%±0.26%、1.86%±0.11%、2.08%±0.22%、1.88%±0.19%、6.00%±0.64%。各实验组鼠精子畸形率与阴性对照组差异无统计学意义，而阳性对照组与阴性对照组鼠精子畸形率相比P均<0.01。

2.2.4亚急性性毒性大鼠 30 d喂养试验周期内各实验组动物总体生长状况良好，体质量逐周增长，未见中毒体征及死亡。各剂量组动物每周体质量、进食量、食物利用率和体质量增加值、总进食量、总食物利用率与对照组比较差异无统计学意义，且其值均在正常值范围内。实验组各剂量组动物各项血液学指标(包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例、单核细胞比例、嗜碱性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞比例)和生化指标(包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白)与对照组比较差异均无统计学意义，且其值均在正常值范围内。解剖后大体观察各实验组动物脏器未见异常。病理组织学检查结果对照组1只雄性、1只雌性大鼠，高剂量组1只雌性大鼠见肝小叶内点状的炎细胞浸润灶。对照组1例雄性大鼠可见个别肾小管变性，表现为小管上皮细胞肿胀，嗜酸性染色减弱，胞质内出现透明空泡样区，胞核疏松淡染，肾小管管腔变窄。对照组1只雄性大鼠、1只雌性大鼠，高剂量组1只雄性大鼠肾间质内可观察到点状炎性细胞浸润灶。以上病变程度较轻且无组间特异性分布，考虑与动物质量有关。脾、胃、肠、卵巢、睾丸等脏器未见明显异常。与对照组相比，实验组肝、肾、脾、胃、肠、卵巢、睾丸没有典型的病理改变。

3　讨论

对壳寡糖的安全性研究表明，给小鼠一次性灌服最大剂量超过10 g/kg的壳寡糖[9],未见任何不良反应。吴胜等[10]研究了壳寡糖的亚急性毒性，认为单一的壳寡糖服用30 d后不产生亚急性毒性，对机体未见不良影响。2014年国家卫生计生委根据《中华人民共和国食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》有关规定，批准壳寡糖为新食品原料[11]。近代医药工作者运用现代医学的观点,对阿胶化学成分及药理作用等进行了多方面的探讨和研究,并取得了大量研究成果。阿胶由骨胶原组成,水解后可得明胶、蛋白质及多种氨基酸。阿胶的蛋白质含量为60%～80%,含有18种氨基酸(包括7种人体必需氨基酸)，所含金属元素有K、Na、Ca、Mg、Fe、Cu、Al、Mn、Zn、Cr、Pt、Pb、Mo、Sr等，具有补血、增强免疫力、抗休克、抗疲劳、抗辐射、抑制肿瘤、促进成骨细胞增殖及升高外周血中白细胞和红细胞等作用[12～16]。郭婕等[17]对单一阿胶进行了毒理学安全性评价，结果未发现毒性。

本研究对壳寡糖阿胶制剂进行了3个阶段的毒理学试验。急性毒性试验结果显示雌雄小鼠MTD均>20.0 g/kg，表明受试物无毒级物质。Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性，表明在本次实验条件下，该受试物无遗传毒性作用。大鼠 30 d喂养试验结果显示在试验期内各实验组动物生长发育良好，体质量增加值、食物利用率、脏器发育情况等各项指标均在正常值范围内。实验组大鼠血常规血红蛋白、红细胞计数、白细胞总数及分类和血生化各指标均在正常范围之内。病理组织学检查显示实验组大鼠被检脏器未见典型的病理改变。表明该样品30 d喂养对大鼠未见亚急性毒性作用。因此我们可以初步认为此壳寡糖阿胶制剂在此剂量下作为保健食品使用是安全可靠的。

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Toxicological studies on preparations of chito-oligosaccharide and E jiao

ZHOUXiaolin1,LULianhua,GUOJie,XIEWei,YANYan,CHENGDong,YANGFei,YAOWenhuan

(1ShandongMentalHealthCenter,Jinan250014,China)

Objective To study the toxicity of chito-oligosaccharide and E jiao preparations. Methods The acute toxicity test of mice was used to detect the acute toxicity of chito-oligosaccharide and E jiao preparations; Ames test, bone marrow cell micronucleus test and sperm shape abnormality test of mice were performed for the genetic toxicity; and the 30-day feeding test of mice was used to detect the subacute toxicity.Results The acute toxicity test of Chito-oligosaccharide and E jiao preparations showed they were non-toxic. The results of genetic toxicity test were all negative, including Ames test, micronucleus test and sperm shape abnormality test. The results of 30-day feeding test had no toxic effect on the observed indexes of rats. ConclusionChito-oligosaccharide and E jiao preparations are non-toxic substances and have no acute toxicity, genetic toxicity and subacute toxicity.

chito-oligosaccharide; E jiao; acute toxicity test; genetic toxicity test; subacute toxicity test; rats

周晓琳(1972-)，女，副主任技师，硕士，主要研究方向为预防医学。E-mail: 1014376287@qq.com

简介：卢连华(1972-)，男，副主任技师, 硕士，主要研究方向为毒理和药理学。E-mail： sdcdc01@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.007

R114

A

1002-266X(2016)26-0024-04

2016-03-12)