他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力、MMP-9活性和表达的影响及机制

陈妍，王婧，徐旖旎，洪端阳，潘迪，沈祥春

(贵州医科大学，贵阳 550025)



他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力、MMP-9活性和表达的影响及机制

陈妍，王婧，徐旖旎，洪端阳，潘迪，沈祥春

(贵州医科大学，贵阳 550025)

目的观察他莫昔芬(TAM)对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力、基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性、MMP-9蛋白表达、MMP-9 mRNA表达的影响，并探讨抑制G蛋白偶联受体30(GPR30)对上述作用的影响。方法 取对数生长期乳腺癌MCF-7细胞，用无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h耗竭内源性雌激素。将MCF-7细胞接种6孔板，待细胞贴壁后分为对照组、TAM组和TAM+G15(GPR30选择性抑制剂)组。对照组用无血清无酚红高糖DMEM培养基继续培养24 h。TAM组用含1 μmol/L TAM的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h，TAM+G15组先用含1 μmol/L的G15的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养30 min，然后用含1 μmol/L TAM的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h。收集各组细胞，用Transwell侵袭实验检测MCF-7细胞侵袭能力，用明胶酶谱法检测MCF-7细胞培养液上清MMP-9活性,用Western blot法检测MCF-7细胞MMP-9蛋白表达，用实时荧光定量PCR法检测MCF-7细胞MMP-9 mRNA表达。结果 与对照组相比，TAM组MCF-7细胞侵袭能力升高，MMP-9蛋白和mRNA表达增加，培养液上清MMP-9活性升高(P均<0. 05)。与TAM组相比，TAM+G15组上述指标均降低(P均<0. 05)。结论TAM可增强乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力，上调MMP-9的活性及表达水平。用GPR30选择性抑制剂G15抑制GR30通路可以抑制这一作用。

他莫昔芬；乳腺癌；基质金属蛋白酶9;G蛋白偶联受体30

他莫昔芬(TAM)属于雌激素受体调节剂(SERMs)，通过与雌激素竞争靶细胞胞质中的雌激素受体(ER)α，抑制ERα功能，发挥拮抗雌激素的作用，是ERα阳性乳腺癌患者内分泌治疗的首选药物。该药能够显著减低ERα阳性乳腺癌患者的病死率，但仅有部分患者能从治疗中获益[1,2]。文献报道，G蛋白偶联受体30(GPR30)与TAM长期使用后复发和转移相关[3]。肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的过程，其中细胞侵袭能力增强和细胞外基质降解是其关键步骤。基质金属蛋白酶(MMPs)是促进细胞外基质降解的关键酶[4]。MMPs家族中基质金属蛋白酶9(MMP-9)是肿瘤细胞转移过程中最重要的蛋白水解酶之一[5]。2014年6月～2015年9月，我们以ERα和GPR30阳性的乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，观察TAM对MCF-9细胞侵袭能力及MMP-9活性和表达的影响，以及GPR30选择性抑制剂G15对上述作用的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料高糖DMEM培养基、无酚红高糖DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；DMSO培养基、TAM、明胶均购自Sigma公司；MMP-9抗体、GAPDH抗体为Bio-world公司产品；BCA试剂盒购自Pierce公司；ECL曝光液为Millipore公司产品；羊抗小鼠或羊抗兔IgG 辣根过氧化物酶(HRP)抗体购自Santa Cruz公司；GPR30特异性拮抗剂G15为Cayman Chemical公司产品；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。乳腺癌MCF-7细胞购自中国科学院昆明细胞库。仪器中CO2培养箱为Thermo公司产品。制胶、电泳和转印系统，ChemiDoc XRS+凝胶成像系统，CFX Connect实时荧光定量PCR仪均为Bio-Rad公司产品。

1.2细胞培养MCF-7细胞培养采用高糖DMEM培养基(含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素)，培养条件为37 ℃及体积分数为5%的CO2，待细胞融合率达90%时进行传代培养。

1.3分组及给药方法取对数生长期MCF-7细胞。给药前改用无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h耗竭细胞内源性雌激素。将MCF-7细胞接种到6孔板中，过夜，待细胞贴壁。设对照组、TAM组和TAM+G15组。对照组用无血清无酚红高糖DMEM培养基继续培养24 h。TAM组用含1 μmol/L TAM的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h，TAM+G15组先用含1 μmol/L G15的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养30 min，然后用含1 μmol/L TAM的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h。每组5个复孔。

1.4MCF-9细胞侵袭能力观察采用Transwell侵袭实验。按照文献[6]操作。各组MCF-7细胞侵袭能力用各组穿过Matrigel 胶微孔滤膜的细胞数与空白对照穿过Matrigel 胶微孔滤膜的细胞数之比表示。

1.5MCF-7细胞MMP-9蛋白表达观察采用Western blot法。收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃、14 000 g离心20 min后取上清液，采用BCA法进行蛋白定量。蛋白变性后按每个泳道30 μg的蛋白总量上样，SDS-PAGE电泳，全湿电转膜仪转膜。用质量浓度为5%的脱脂奶粉于37 ℃ 振摇1 h 进行封闭。分别加入MMP-9或GAPDH一抗，37 ℃ 振摇1 h，4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗37 ℃振摇1 h后，采用ECL曝光液进行曝光。以GAPDH为内参照，采用Image Lab软件分析图像获得各组MMP-9相对表达量。

1.6MCF-7细胞MMP-9 mRNA表达观察采用实时荧光定量PCR法。收集各组细胞。按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA，并用紫外分光光度计检测纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。按照逆转录试剂盒的说明将RNA逆转录为cDNA。依据文献报道设计引物，MMP-9的上游引物为5′-GTGGGGATTTACATGGCACT-3′，下游引物为5′-AAAGCCTATTTCTGCCAGGAC-3′；β-actin上游引物为5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物为5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。按PCR试剂盒的说明书在荧光定量PCR仪上进行扩增。以β-actin为内参照按照2-ΔΔCt法计算MMP-9 mRNA相对表达量。

1.7MCF-7细胞培养液上清MMP-9活性观察采用明胶酶谱实验。收集各组培养液上清液。将明胶加入SDS-PAGE分离胶液中，使明胶的浓度为0.1%，加入各组培养液上清液后电泳。电泳结束后，将丙烯酰胺凝胶进行复性、孵育染色和洗脱至负染条带清楚。采用凝胶成像系统扫描拍照，并用Image Lab软件分析图像，计算各组MMP-9活性，以各组MMP-9条带与空白对照条带灰度值之比表示MMP-9活性。

2　结果

2.1各组MCF-7细胞侵袭能力比较对照组、TAM组、TAM+G15组MCF-7细胞侵袭能力分别为100%±0.3%、201.4%±16.7%、125.2%±17.9%，TAM组MCF-7细胞侵袭能力高于对照组和TAM+G15组(P均<0.05)，TAM+G15组与对照组相比差异无统计学意义。

2.2各组MCF-7细胞MMP-9蛋白表达比较对照组、TAM组、TAM+G15组MCF-7细胞MMP-9蛋白相对表达量分别为100%±0.1%、232.5%±27.5%、127.5%±12.5%，TAM组MCF-7细胞MMP-9蛋白相对表达量高于对照组和TAM+G15组(P均<0. 05)，TAM+G15组与对照组相比差异无统计学意义。

2.3各组MCF-7细胞MMP-9 mRNA表达比较对照组、TAM组、TAM+G15组MCF-7细胞MMP-9 mRNA相对表达量分别为1.0±0.1、1.94±0.08、1.06±0.14，TAM组MCF-7细胞MMP-9 mRNA相对表达量高于对照组和TAM+G15组(P均<0.05)，TAM+G15组与对照组相比差异无统计学意义。

2.4各组MCF-7细胞培养液上清MMP-9活性比较对照组、TAM组、TAM+G15组MCF-7细胞培养液上清MMP-9的活性分别为100%±0.2%、253.3%±30.9%、93.0%±12.4%，TAM组MCF-7细胞培养液上清MMP-9活性高于对照组和TAM+G15组(P均<0.05)，TAM+G15组与对照组相比差异无统计学意义。

3　讨论

雌激素在乳腺癌的发生和发展中起着重要作用。最初的研究发现，雌激素可通过经典的雌激素受体ERα和ERβ来发挥效应。ERα在雌激素发挥生理作用的各个过程中都有参与，故学者们研发了多种干预ERα的内分泌治疗药物，如ER调节剂TAM和ER拮抗剂氟维司群(ICI)。但是近年来的研究发现，TAM也可发挥类似雌激素的作用。TAM的活性代谢产物4-羟基他莫昔芬(OHT)与雌激素作用类似，能够促进ERα阴性乳腺癌SR-BR-3细胞的增殖[7]，并增强子宫内膜癌Ishikawa和KLE细胞的增殖和侵袭能力[8]。本研究结果显示，TAM能够增强ERα阳性乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力，提高其MMP-9蛋白、mRNA的表达和活性。提示仅仅通过抑制ERα功能来治疗乳腺癌可能存在一定的局限性，乳腺癌的治疗还需要寻找和发现新的靶点。

GPR30是近年发现的一种新型雌激素受体，它与经典的ERα没有同源性，效应和作用机制也有所不同，主要介导雌激素快速非基因效应[9]。GPR30与乳腺癌的发生及其生物学行为有一定程度的相关性。在侵袭性乳腺癌组织中GPR30过表达[10]，并且GPR30表达与乳腺癌的远处转移呈正相关[11]。在GPR30敲除的自发性乳腺癌MMTV-PyMT小鼠中，乳腺癌转移率显著下降[12]。这些研究表明，GPR30可能是乳腺癌治疗的又一靶点。TAM和ICI虽然能够抑制ERα功能，但却能够激活GPR30。本课题组前期研究发现，OHT能够通过GPR30介导乳腺癌细胞中细胞周期蛋白E(cyclin E)剪切形成小分子片段发挥类似雌激素的作用，而小分子cyclin E的形成提示乳腺癌预后不良[13]。此外，雌激素和ICI都能够通过GPR30促进乳腺癌MCF-7和SK-BR-3细胞与胞外基质黏附以及钙蛋白酶1的激活[14]。提示激活GPR30通路可能是TAM或ICI这类内分泌治疗药物发挥类似雌激素作用的机制之一。

卵巢子宫内膜异位囊肿和上皮性卵巢癌中GPR30和MMP-9的表达呈正相关[15, 16]。雌激素和GPR30选择性激动剂G1能够上调卵巢癌 OVCAR5细胞中MMP-9的表达和水解能力，采用siRNA沉默GPR30的表达或者采用G蛋白的抑制剂百日咳毒素抑制GPR30的活性可阻断雌激素和G1的这一效应[17]。这说明GPR30可能调控MMP-9的活性和表达。在本研究中，采用GPR30的特异性抑制剂G15预处理MCF-7细胞后，TAM增强MCF-7细胞的侵袭能力、上调MMP-9的活性和表达的作用均被抑制，这提示抑制GPR30的作用可能是阻碍TAM发挥类似雌激素效应的途径之一。这也提示在乳腺癌内分泌治疗中除用TAM阻断ERα信号通路以外，可能还需抑制GPR30信号通路。

[1] Jager NG， Linn SC， Schellens JH， et al. Tailored tamoxifen treatment for breast cancer patients: a perspective[J]. Clin Breast Cancer， 2015，15(4)：241-244.

[2] Viedma-Rodriguez R， Baiza-Gutman L， Salamanca-Gomez F， et al. Mechanisms associated with resistance to tamoxifen in estrogen receptor-positive breast cancer[J]. Oncol Rep， 2014，32(1)：3-15.

[3] Mo Z， Liu M， Yang F， et al. GPR30 as an initiator of tamoxifen resistance in hormone-dependent breast cancer[J]. Breast Cancer Res， 2013，15(6)：R114.

[4] Kessenbrock K， Plaks V， Werb Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment[J]. Cell， 2010，141(1)：52-67.

[5] Bauvois B. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers: outside-in signaling and relationship to tumor progression [J]. Biochim Biophys Acta，2012，1825(1)：29-36.

[6] 卢科莲，喻小兰，夏纪毅，等. 黄芩素对宫颈癌Hela 细胞增殖的抑制作用及机制探讨[J]. 山东医药，2014，54(27)：4-7.

[7] Vivacqua A， Romeo E， de Marco P， et al. GPER mediates the Egr-1 expression induced by 17beta-estradiol and 4-hydroxitamoxifen in breast and endometrial cancer cells[J]. Breast Cancer Res Treat， 2012，133(3)：1025-1035.

[8] Du GQ， Zhou L， Chen XY，et al. The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the proliferative and invasive effects induced by hydroxytamoxifen in endometrial cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，420(2)：343-349.

[9] Maggiolini M， Picard D. The unfolding stories of GPR30, a new membrane-bound estrogen receptor[J]. J Endocrinol， 2010，204(2)：105-114.

[10] Liu Q， Li JG， Zheng XY， et al. Expression of CD133, PAX2, ESA, and GPR30 in invasive ductal breast carcinomas[J]. Chin Med J (Engl)， 2009，122(22)：2763-2769.

[11] Filardo EJ， Graeber CT， Quinn JA， et al. Distribution of GPR30, a seven membrane-spanning estrogen receptor, in primary breast cancer and its association with clinicopathologic determinants of tumor progression[J]. Clin Cancer Res， 2006，12(21)：6359-6366.

[12] Marjon NA， Hu C， Hathaway HJ， et al. G protein-coupled estrogen receptor regulates mammary tumorigenesis and metastasis[J]. Mol Cancer Res， 2014，12(11)：1644-1654.

[13] Li Y， Chen Y， Zhu ZX， et al. 4-Hydroxytamoxifen-stimulated processing of cyclin E is mediated via G protein-coupled receptor 30 (GPR30) and accompanied by enhanced migration in MCF-7 breast cancer cells[J]. Toxicology， 2013，30(9)：61-65.

[14] Chen Y， Li Z， He Y， et al. Estrogen and pure antiestrogen fulvestrant (ICI 182 780) augment cell-matrigel adhesion of MCF-7 breast cancer cells through a novel G protein coupled estrogen receptor (GPR30)-to-calpain signaling axis[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2014，275(2)：176-181.

[15] Long L， Cao Y， Tang LD. Transmembrane estrogen receptor GPR30 is more frequently expressed in malignant than benign ovarian endometriotic cysts and correlates with MMP-9 expression[J]. Int J Gynecol Cancer， 2012，22(4)：539-545.

[16] Liu HD， Yan Y， Cao XF， et al. The expression of a novel estrogen receptor, GPR30, in epithelial ovarian carcinoma and its correlation with MMP-9[J]. Acta Physiol Sinica， 2010，62(6)：524-528.

[17] Yan Y， Liu H， Wen H， et al. The novel estrogen receptor GPER regulates the migration and invasion of ovarian cancer cells[J]. Mol Cell Biochem， 2013，378(1-2)：1-7.

Effects of tamoxifen on invasion, activity and expression of MMP-9 in breast cancer MCF-7 cells

CHENYan,WANGJing,XUYini,HONGDuanyang,PANDi,SHENXiangchun

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

Objective To explore the effects of tamoxifen (TAM) on the invasion, activity and expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in breast cancer MCF-7 cells, meanwhile to discuss the role of inhibiting G-protein-coupled receptor 30 (GPR30) in these effects. Methods MCF-7 cells in the logarithmic phase were pre-cultured for 24 h in phenol red (PR)-free medium without serum to remove endogenous estrogen before the indicated treatments. MCF-7 cells were seeded in the six-well plates and incubated over night to let them adhere on the plate. The control group was continued to cultivate in PR-free medium without serum for 24 h. The TAM group was treated with 1 μmol/L TAM in PR-free medium without serum for 24 h. And the TAM+G15 group was pretreated with G15 (1 μmol/L) for 30 min before treatment with TAM (1 μmol/L) for 24 h in PR-free medium without serum. After treatment, cell invasion was detected by Transwell assay. The activity of MMP-9 in culture medium was tested by Gelatin zymography assay. The MMP-9 protein expression was analyzed by Western blotting. The mRNA expression of MMP-9 was tested by real-time RT-PCR. Results Compared with control group, the cell invasion was increased, the protein and mRNA expression level of MMP-9 was up-regulated, and the activity of MMP-9 in MCF-7 cells was increased in the TAM group (allP<0.05). Furthermore, compared with the TAM group, the above indexes of the TAM+G15 group were all decreased (allP<0.05).Conclusions TAM promotes the cell invasion ability and up-regulates the activity and expression of MMP-9. Meanwhile, the effects may be suppressed by G15 pretreatment.

tamoxifen; breast carcinoma; G-protein-coupled receptor 30; matrix metalloproteinase-9

国家自然科学基金资助项目(81302804)；贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J字20142007号)；贵州省高校优秀科技创新人才支持计划项目(黔教合KY字2015492)；贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题(20141001)。

陈妍(1985-)，女，博士，副教授，主要研究方向为抗肿瘤药物药理。E-mail: s0710189@sina.com

简介：沈祥春(1973-)，男，博士，教授，研究方向为中药民族药活性。E-mail: shenxiangchun@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.002

R737.9

A

1002-266X(2016)26-0006-04

2016-05-11)