局部联合移植hUCMSCs与VEGF对MCAO大鼠神经功能的影响

王　盼　单　伟辽宁医学院，辽宁锦州　121000

局部联合移植hUCMSCs与VEGF对MCAO大鼠神经功能的影响

王盼单伟▲
辽宁医学院，辽宁锦州121000

目的将血管内皮生长因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）与体外培养的人脐带间充质干细胞（human umbi1ica1 cord derived mesenchyma1 stem ce11s，hUCMSCs）联合植入脑缺血（midd1e cerebra1 artery occ1usion，MCAO）模型大鼠脑内，观察神经功能改善情况。 方法选择75只SD大鼠，实验分组如下：MCAO组，仅制备缺血模型；假手术组，仅分离颈总动脉，不栓塞；VEGF组，缺血24 h后，局部缺血区给予VEGF治疗；hUCMSCs组，缺血24 h后，局部缺血区给予hUCMSCs治疗；hUCMSCs+VEGF联合组，缺血24 h后，局部缺血区给予hUCMSCs+ VEGF治疗。观察缺血前、缺血后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d各个时间点改良神经功能评分（mNSS）变化。结果hUCMSCs的增殖及分化不受Brdu标记的影响；缺血后，随着治疗时间的延续，单因素治疗组内（VEGF组、hUCMSCs组）大鼠的mNSS评分减低，联合组治疗效果优于单独因素处理组，且在不同时间点之间有显著性差异（F= 5.018，P＜0.01）。MCAO组的mNSS评分高于VEGF组、hUCMSCs组和联合组，差异有统计学意义（P＜0.05），在所选择观察的6个时间点内，联合组21 d时mNSS评分得分最低。结论VEGF联合hUCMSCs移植入MCAO模型大鼠脑内，可促进缺血模型大鼠的神经功能恢复。

脑缺血；脐带间充质干细胞；血管内皮细胞生长因子；神经功能

［Abstract］Objective To imp1ant vascu1ar endothe1ia1 growth factor（VEGF）and human umbi1ica1 cord derived mesenchyma1 stem ce11s（hUCMSCs）together into the brain of mode1 rats with midd1e cerebra1 artery occ1usion（MCAO）and observe the nerve function improvement situation.Methods Seventy-five SD rates were divided into the fo11owing groups:MCAO group，in which on1y ischemia mode1 was estab1ished，fake surgery group，in which on1y common carotid artery was separated without embo1ism，VEGF group，in which VEGF treatment was given in 1oca1 ischemic region 24 hours after ischemia，hUCMSCs group，in which hUCMSCs treatment was given in 1oca1 ischemic region 24 hours after ischemia，and hUCMSCs+VEGF combination group，in which hUCMSCs+VEGF treatment was given in 1oca1 ischemic region 24 hours after ischemia.The changes of modified neuro1ogica1 severity scores（mNSS）before ischemia and 1 day，4 days，7 days，14 days and 21 days after ischemia were observed.Results Pro1iferation and differentiation of hUCMSCs were not inf1uenced by Brdu mark.After ischemia，as treatment continued，mNSS scores of the sing1e factor treatment groups（VEGF group and hUCMSCs group）reduced，and combined treatment group was better than sing1e factor treatment group in treatment effects，with significant differences at different time points（F=5.018，P＜0.01）.Compared with the VEGF group，hUCMSCs group and combined group，the score of mNSS of the MCAO group was higher，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05），score of mNSS in the combined group showed the 1owest scoring at the 21 d，in the se1ected six time point.Conclusion Combined transp1antation of VEGF and hUCMSCs into brain of MCAO mode1 rates can promote the nerve function recovery of ischemic mode1 rats.

［Key words］Cerebra1 ischemia；Umbi1ica1 cord mesenchyma1 stem ce11s；Vascu1ar endothe1ia1 growth factor；Nerve function

脑缺血是临床上神经系统疾病中较为常见，并且在临床上有着高发病率、高致残率、高死亡率的三大显著特点，尤其是对老年人群的危害性更为明显［1，2］，这也就要求我们研究者给予更多的关注。今年来随着科技的不断进步，越来越多的实验已经证实干细胞对于脑缺血可以发挥神经保护作用，从不同程度上可以缓解脑组织急性缺血所带来的损伤。作为间充质干细胞中取材、培养都有着独特优势的脐带间充质干细胞，可以对脑缺的症状有一定的恢复［3］。而血管内皮生长因子（VEGF）作为血管再生过程中最为重要的经典因子在脑缺血后的保护作用也从血管再生方面引起了人们越来越多的重视［4］。本研究将hUCMSCs与VEGF联合移植入缺血模型大鼠局部脑区，在不同时间点比较联合组与单一因素处理组之间的大鼠神经功能情况，从而来进一步为探讨两者联合对脑缺血的神经保护作用提供实验依据。现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料来源

75只成年SD健康大鼠，雌雄均可，体重290～320 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。实验所需编号为G1161的人脐带间充质干细胞，来源于天津国家干细胞中心。本实验于2010年3月～2011年12月期间于辽宁医学院完成。

1.2实验方法

1.2.1hUCMSCs的培养、标记 将纯化的第3代hUCMSCs用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）进行消化、处理后，重新铺培养，待细胞之间有70%融合后，5-溴脱氧尿苷（BrdU）进行标记，培养时间为48 h，当大部分细胞在90%融合的条件下，观察，1×PBS清洗、收集，便于细胞移植备用。

1.2.2Brdu阳性细胞的检测及计数将细胞爬片取出，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗3次，每次5 min。含5%BSA封闭液4℃封闭1 h，一抗羊抗兔BrdU单克隆抗体（1∶200）4℃冰箱，过夜结合。室温复温1 h，1×PBS液体漂洗3次，滴加相应二抗，室温孵育1 h。DAB显色，永久封片剂封片。Leica DM4000显微镜下，明视野400倍下观察，采集图像。

1.2.3缺血动物模型的制备 根据Longa等［5］所建立的改良线栓法，制备大鼠脑缺血模型，每组各个时间点制备缺血模型5只。假手术组：仅有一侧的颈总动脉不给予线栓，也不给予任何治疗；MCAO仅分离颈总动脉，将自制的鱼线插入大脑中动脉，制备缺血模型；VEGF组，模型制备成功24 h后，在缺血区和缺血区周围注射VEGF；hUCMSCs组，模型制备成功24 h后，在缺血区和缺血区周围注射hUCMSCs；联合组则是在模型制备成功24 h后，在缺血区和缺血区周围注射hUCMSCs+VEGF。

1.2.4移植10 μL Brdu标记的hUCMSCs用于移植hUCMSCs组，浓度为1×106个/μL。收集含VEGF的细胞悬液10 μL，VEGF浓度为10 ng/mL，用于联合组。将大鼠麻醉后，固定在立体定位仪上，根据图谱确定具体注射位点为：皮质区（AP=-1.0 mm；ML=2.0 mm；DV=2.0 mm）；缺血边缘区（AP=-1.0 mm；ML=4.0 mm；DV=4.5 mm）1 μL/min采用微量注射器缓慢注射，留针5 min。术毕，骨窗用骨蜡予以封闭。

1.3神经功能评分

以mNSS评分标准［6］为评分依据，在以下6个时间点对动物进行改良神经功能评分判定，具体时间点为：对缺血前、缺血后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d 6个时间点。根据各组间所得分数进行比较，0分为正常，18分为最高功能障碍。

1.4统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（）表示，采用析因方差分析、t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1纯化标记的细胞检测效果

光镜下观察细胞的形态、确定标记后的细胞增殖及分化均未受到外界影响。经免疫组织化学染色后，48 h，标记率可达到98%以上，深棕色为Brdu标记的细胞核。见封三图1。

2.2mNSS评分

未造模前各组大鼠的神经功能正常；造模24 h后，除假手术组外，各组大鼠神经功能评分之间差异无统计学意义（P＞0.05）；所观察的各个时间段，不同处理组之间的评分不同，除假手术组、MCAO组外，差异有统计学意义（P＜0.05）。处理因素与治疗时间两者有协同作用（F=5.595，P＜0.01），交互效应图见封三图2；MCAO组的mNSS评分高于VEGF组、hUCMSCs组和联合组，差异有统计学意义（P＜0.05），在所选择观察的6个时间点内，联合组21 d时mNSS评分得分最低。见表1。

表1　不同组别大鼠在不同时间的mNSS评分（，n=5）

表1　不同组别大鼠在不同时间的mNSS评分（，n=5）

注：不同时间点各组间（F总=220.249，P＜0.01），假手术组内（P＞0.05），MCAO组内（F=4.713，P＞0.05），hUCMSCs组（F=5.212，P＜0.05），VEGF组（F=5.695，P＜0.05），联合组（F=5.018，P＜0.01）。※与假手术组比较，缺血后1 d，t=2.368、2.287、2.276、2.201，缺血后4 d，t=2.469、2.398、2.167、2.248；缺血后7 d，t=2.618、2.541、2.609、2.264；缺血后14 d，t=2.63、2.386、2.371、2.296；缺血后21 d，t=2.628、2.308、2.316、2.281；P＜0.05；*与MCAO组比较，缺血后7 d，t=2.636、2.576、3.108；缺血后14 d，t=2.416、2.916、3.108；缺血后21 d，t=2.371、2.812、2.989；P＜0.05，△与hUCMSCs组比较，t=2.579、2.627、2.631，P＜0.05；#与VEGF组比较，t=2.682、2.618、2.718，P＜0.05

组别　缺血前假手术组MCAO组hUCMSCs组VEGF组联合组缺血后1 d　缺血后4 d　缺血后7 d　缺血后14 d　缺血后21 d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.24±0.64 13.83±0.75※13.67±1.03※13.58±1.36※13.67±1.21※1.30±0.32 13.33±2.08※12.67±2.92※12.47±3.50※11.57±3.42※1.15±0.19 12.62±0.93※11.63±0.89※*11.80±1.41※*10.97±0.50※*△#0.00±0.00 11.67±1.03※11.22±0.35※*11.00±1.67※*10.45±0.31※*△#0.00±0.00 11.42±3.02※10.22±3.28※*10.58±2.02※*8.92±2.73※*△#

3　讨论

众所周知，在脑缺血后的一段时间内会有神经的自我恢复，在这一过程中常与神经元及其突触可塑性是相伴随而发生的［7］。人脐带间充质干细胞最易于应用于临床，是因为其可以取自于本人，能够避免异体移植所带来的排斥反应，取材也十分便利，避免了伦理道德的争议。虽然目前干细胞治疗脑缺血的实验机制尚未明确，但其对于大鼠脑缺血症状的改善已经得到了证实。本实验结果显示，hUCMSCs组和MCAO组的神经功能评分相比较，表明移植干细胞可以治疗脑缺血，机制可能是缺血区有hUCMSCs的迁移，从而改善了脑缺血的症状。

在脑缺血发生的过程中，缺血梗死区及缺血区得周边可能会发生一系列的病理变化［8-9］，包括：细胞凋亡、炎症反应以及神经内分泌改变等，可以影响所移植细胞的分化率和存活率。到目前为止，研究者们仍然在探讨移植干细胞后所移植细胞的存活率以及存活状态［10］。VEGF是具有较高活性的多聚肽类物质，已有研究证实，VEGF可以作为直接促进神经再生。并且能否诱导下游的Src家族激酶，可以对抗脑缺血后血管渗漏，并且可以发挥阻止水肿形成的作用。另一方面，也能够直接抑制神经元细胞凋亡的数量，从而提高学习及记忆的能力［11，12］。因此，本实验显示，移植VEGF 21 d后，VEGF组和MCAO组比较神经功能评分有明显改善。

本实验采用联合移植于脑缺血区的局部，观察其行为学神经功能评分的改变。mNSS评分从5个方面进行神经功能的综合评分，通过有无异常运动、感觉方面、运动方面、运动是否丧失、平衡木实验等这5个方面评分能够对大鼠的神经功能改变进行权威的评判。实验数据显示，最为显著的指标是运动功能的改变。在经过联合组，治疗后21 d后，缺血鼠的神经功能状态得以改善，运动方面功能恢复，缺血后患侧肢体向对侧屈曲的程度有所好转，随着给予治疗时间的延长，可以看出联合治疗组与MCAO组比较统计学差异更为显著（P＜0.05），与VEGF和hUCMSCs组比较有显著差异（P＜0.05），提示联合治疗能够改善缺血大鼠神经症状。VEGF和hUCMSCs两者联合的协同效应可能是由于一方面干细胞与缺血区代偿的脑部神经干细胞进行整合；另一方面，两者共同存在情况下能够促微血管再生，使缺血区的血运增加，进而发挥对缺血的治疗作用［13-15］。

综上，VEGF联合hUCMSCs移植入MCAO模型大鼠脑内，可促进缺血模型大鼠的神经功能恢复。

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Influence of local combined transPlantation of hUCMSCs and VEGF on nerve function of MCAO rats

WANG PanSHAN Wei
Laioning Medica1 Co11ege，Jinzhou121000，China

R743.31

A

1673-97O1（2O16）11-OO17-O3

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2013332）▲

2016-02-29）