微弧氧化处理对钛片表面人成骨细胞附着、增殖及活性的影响
2016-09-05马敏先周震王永杨静张俊标刘琴王梅
马敏先，周震，王永，杨静，张俊标，刘琴，王梅
(1贵州医科大学附属医院，贵阳550004；2广东省口腔医院；3贵阳市口腔医院)
微弧氧化处理对钛片表面人成骨细胞附着、增殖及活性的影响
马敏先1，周震2，王永1，杨静1，张俊标1，刘琴1，王梅3
(1贵州医科大学附属医院，贵阳550004；2广东省口腔医院；3贵阳市口腔医院)
目的观察微弧氧化(MAO)处理对钛片表面人成骨细胞附着、增殖及活性的影响。方法将90片钛片分为观察组、对照组和空白组各30片，观察组和对照组分别采用MAO法、双氧水处理，空白组为纯钛对照。取对数生长期人成骨细胞100 μL细胞悬液涂布于各组钛片表面。分别于培养1、2、3、6、7、8 d采用血球计数板计数钛片表面附着成骨细胞数，采用MTT法测定培养1、2、3、6 d各组细胞增殖抑制率，采用ALP试剂检测各组培养3、6 d时ALP活性。结果培养 3、6、7、8 d，钛片表面附着人成骨细胞数均观察组>对照组>空白组，P均<0.05。培养3、6 d时，细胞增殖率均观察组>对照组>空白组，P均<0.05。培养3、6 d时ALP活性均观察组>对照组>空白组，P均<0.05。结论MAO处理钛片与人成骨细胞生物相容性较好，可促进人成骨细胞早期附着和细胞增殖，提高ALP活性。
成骨细胞；微弧氧化法；纯钛；生物相容性；碱性磷酸酶
目前，钛片表面化学成分的改变是口腔种植体研究的热点，可使商业纯钛转化为生物活性材料[1,2]，在种植体表面形成一层生物活性膜或涂层, 最终诱导骨组织形成，达到生物化学结合[3～5]。但是，成骨细胞附着数量、增殖活性是能否成功的基础，附着成骨细胞是否具有成骨细胞活性是关键，碱性磷酸酶(ALP)常用于成骨功能活性检测。微弧氧化(MAO)技术是专门用于铝、钛、镁等金属进行表面处理的一种新技术，能在金属表面形成一层含有不同比例钙磷元素粗糙多孔又耐腐蚀的氧化层,水热处理后还可在金属氧化层上沉积羟基磷灰石晶体[6], 使其具有生物活性。2012年9月～2015年6月，我们采用MAO法处理钛片，并用其体外培养成骨细胞，观察细胞的附着能力、增殖及活性，旨在探讨MAO应用于钛植入材料表面处理的可能性。现报告如下。
1 材料与方法
1.1材料人成骨细胞来自我院计划生育科，于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/mL的DMEM培养液中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。TA2纯钛片(直径10 mm，深圳全宇钛业代理山西宝钛)；MAO-1脉冲直流微弧氧化电源设备(成都普斯特电源有限公司)，CO2细胞培养箱、Bio-Tek E1312E酶标光度仪、24孔培养板(美国Forma Scientific 公司) , 一次性微孔滤膜滤器(爱尔兰Carrighwohill公司)，胎牛血清(FCS) 、DMEM培养基 (美国GIBCO公司),乙二胺四乙酸(EDTA，以色列SIGMA公司), 胰蛋白酶(美国DIFCO公司), MTT试剂检测盒(南京建成生物有限公司 ), 二甲基亚砜(DMSO，武汉博士德公司),ALP试剂检测盒(南京建成生物有限公司), Ⅱ型胶原酶(美国GIBCO公司), 丙酮(成都科龙化工试剂厂, 分析纯), 600目砂(上海钻石牌), 乙酸钙(无锡阳山生化有限公司, 分析纯), 磷酸二氢钠(嘉兴市昌利化工有限公司, 分析纯)。
1.2钛片处理及分组 将TA2纯钛片线切割加工成厚1 mm圆钛片，以金相砂纸逐级打磨至600目，清洗后得到光滑钛片。然后用石油醚、乙醇和去离子水在超声清洗器(KQ250)中轮流清洗3次，以除去材料表面机械加工时而残留的油污。将处理后钛片分为观察组、对照组和空白组组。观察组将钛片置入微弧氧化设备中，以0.2 mol/L磷酸二氢钠和0.4 mol/L乙酸钙作为电解液，将纯钛片作为阳极浸入电解液中，不锈钢槽作为阴极，接入平均电压150 V，频率300 Hz，占空系数20%，处理时间为120 s，电流密度3 A/dm2。同时不断搅拌电解液，使槽温控制于30 ℃左右，制备得MAO处理钛片。对照组使用5.80 mol/L HCl和8.96 mol/L H2SO4混合液处理10 min，双蒸水冲洗，50℃干燥；8.8 mol/L H2O2、80 ℃处理30 min，400 ℃热处理1 h，制备得到双氧水处理钛片。空白组为纯钛,不做任何处理。每组各30片钛片。处理完毕后采用钛片扫描电子显微镜观察各组钛片情况，镜下可见观察组纯钛表面粗糙不平，有大小不一类似蜂窝状微孔，微孔周围有类似火山丘状形态，这些孔互相不连通，孔径较均匀；对照组纯钛表面粗糙不平；空白组纯钛表面可见明显的划痕。
1.3人成骨细胞的接种分别取各组钛片，置于24孔板内。取对数生长期人成骨细胞，调整细胞浓度至1×105/mL;各取100 μL细胞悬液涂布于上述钛片表面，6 h后每孔加入2 mL DMEM培养液，置于CO2孵育箱内继续培养。
1.4钛片表面附着人成骨细胞数测定采用血球计数板。分别于培养1、2、3、6、7、8 d取各组钛片培养板，每组4孔，Hanks液冲洗3遍，置于另一块洁净12孔板内；胰蛋白酶消化3 min，收集上层清液；1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，混匀后采用血球计数板计数，将计数结果换算为每微升悬液所含细胞数。
1.5人成骨细胞增殖检测采用MTT法。分别于培养1、2、3、6 d取各组钛片培养板，每组4孔，加入MTT培养液100 μL/孔，继续培养6 h;弃去培养液后取出试件，于另一培养板中放置。空白组弃去培养液即可。然后加入DMSO 1.0 mL/孔，振荡10 min，测波长490 nm的光密度(OD)值，重复3次，取平均值计算各组细胞增殖率。细胞增殖率=(观察组OD值-阴性对照OD值)/阴性对照OD值×100%。
1.6人成骨细胞ALP活性测定取各组钛片培养板，每组4孔，加入含有维生素C 50 mg/mL、磷酸甘油钠10 mmol/L、地塞米松10 mmol/L的矿化液培养；分别于培养3、6 d，弃去培养液,Hanks冲洗3次；加入TritonX100 μL(2 mol/L),4 ℃冰箱过夜。再加入ALP底物150 μL，37 ℃环境保持30min，以KOH 100 μL/孔(0.1 mol/L)中止反应。测波长410 nm的OD值以此代表细胞ALP活性。为除外细胞增殖抑制率的不同对ALP活性影响，采用ALP测得OD值/同期成骨细胞增殖率进行修正。
2 结果
2.1各组钛片表面附着人成骨细胞数比较见表1。
注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05.
2.2各组细胞增殖率比较见表2。
表2 各组细胞增殖率比较
注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05。
2.3各组细胞ALP 活性比较见表3。
表3 培养3、6 d时各组ALP活性比较
注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05。
3 讨论
种植体种植成功的关键在于形成良好的种植体-骨性界面的结合，即骨整合。骨整合是指种植体表面和周围健康骨组织之间没有任何纤维结缔组织间隔的直接连接，具有分散功能性负重的能力，且不会对邻近组织及全身产生不利影响。骨-种植体的骨整合是代谢活跃的骨组织和具有生物相容性的金属这两种不同材料的结合，除患者生理条件、可用骨量等宿主因素和手术损伤的负重时机等医源性因素以外，最主要的影响因素就是处理后种植体表面生物黏附力、表面张力、表面亲水性、骨组织亲和力和电势能等[7，8]。因此，粗糙且具有生物活性的种植体界面尤为重要。Ward 等[9]研究发现，成骨细胞在粗糙面上的黏附性能更好，而且可以沉淀更多的钙、磷元素。因此，均匀多孔的表面形貌将增加材料表面的粗糙度，有利于钛合金与骨组织形成强的化学连接。
钛片是加工后的矢量式金属片，机械强度高，比重小，有较好生物相容性，目前已广泛用于医疗行业。双氧水法在反应表面可形成一层具有生物活性的二氧化钛凝胶层,该层在体外模拟体液中具有诱导形成羟基磷灰石的能力[10]。王永等[11]发现双氧水处理组的优于各传统粗化及酸蚀处理组,采用双氧水法处理可以更有效促进大鼠成骨细胞在纯钛表面的附着、增殖，并提高大鼠成骨细胞的ALP活性。但双氧水法操作复杂，设备要求较高，且处理后钛片与成骨细胞相容性较低。MAO法是通过电解液和相关的电参数进行组合，可在钛金属表面通过弧光放电瞬时产生高温高压而产生以基底金属氧化物为主的一层陶瓷膜[12,13]，即二氧化钛氧化膜;且陶瓷膜钙磷元素比例合适，有利于羟基磷灰石的形成，从而增强骨细胞与材料表面的良好结合[14,15]，防止出现种植体表面活性膜脱落而造成的种植体植入后失败。
相对于附着和增殖情况,成骨细胞在材料表面的功能更为重要。ALP是成骨细胞矿化过程中主要的功能活性酶[16,17]，其可以间接反映成骨细胞的分化程度和功能状态[18,19]。因此，ALP被普遍认为能够反映成骨细胞形成骨基质的能力,是成骨细胞分化和功能的重要标志[20,21]。本研究结果发现，培养1 d时，成骨细胞已附着在各组钛片表面,但细胞数目变化不大,为细胞的潜伏适应期;从培养2 d起,细胞进入对数生长期，至培养6 d达到高峰；培养6 d后细胞进入生长平缓期。培养 3、6、7、8 d时钛片表面附着人成骨细胞数均观察组>对照组>空白组，培养、3、6 d时细胞增殖率均观察组>对照组>空白组，培养3、6 d时ALP活性均观察组>对照组>空白组。说明MAO法处理钛片与人成骨细胞生物相容性较好，可提高人成骨细胞早期附着，促进细胞增殖，提高ALP活性，但其具体机制尚需进一步研究。
[1] Albrektsson T, Wennerberg A. Oral implant surfaces: Part 1--review focusing on topographic and chemical properties of different surfaces and in vivo responses to them[J]. Int J Prosthodont, 2004,17(5):536-543.
[2] Velasco-Ortega E, Alfonso-Rodríguez CA. Relevant aspects in the surface properties in titanium dental implants for the cellular viability [J]. Mater Sci Engine C，2016，64(7):1-10.
[3] Lang NP， Jepsen S. Implant surfaces and design[J]. Clini Oral Implant Res, 2009,20(4):228-231.
[4] Kaneko S, Tsuru K, Hayakawa S, et al. In vivo evaluation of bone-bonding of Titanium metal chemically treated with a Hydrogen peroxide solution containing Tantalum chloride[J]. Biomaterials, 2001,22(9):875-881.
[5] Wang XX, Hayakawa S, Tsuru K, et al. A comparative study of in vitro apatite deposition on heat, H2O2-, and NaOH-treated Titanium surfaces[J]. J Biomed Mater Res, 2001,54(2):172-178.
[6] Han YH, Ciapetti GC. In vitro evaluation of cell/biomaterial by MTT assay[J]. Biomaterials, 1993,14(5):359-364.
[7] Jones FH. Teeth and bones : applications of surface science to dental materials and related biomaterials[J]. Surf Sci Rep, 2001,42(3):75-79.
[8] Martin JY, Schwartz Z, Hummert TW, et al. Effect of titanium surface roughness on proliferation differentiation and protein synthesis of human osteoblast-like cells (MG63)[J]. J Biomed Mater Res, 1995,29(3):389-401.
[9] Ward BC, Webster TJ. Increased functions of osteoblasts onnanophase metals materials[J]. Sci ErIg, 2007,27(3):575-578.
[10] Ramires PA, Giuffrida A, Milella E. Three-dimensional Reconstruction of confocal laser microscopy images to study the behaviour of osteoblastic cells grown on biomaterials[J]. Biomaterials, 2002,23(2):397-406.
[11] 王永, 陈虹羽, 张军梅, 等．经双氧水处理后的纯钛片对成骨细胞表面附着及增殖活性的影响[J]．山东医药, 2008,48(17)：12-13．
[12] 薛文斌, 邓志威, 张通和, 等．铸造镁合金微弧氧化机理[J]．稀有金属材料与工程, 1999, 28(6)：353-356．
[13] Tian P, Liu X. Surface modification of biodegradable magnesium and its alloys for biomedical applications [J]．Regen Biomater, 2015,2(2):135-151.
[14] Guo Z, Zhou L, Rong M, et al．Bone response to a pure titanium implant surface modified by laser etching and microarc oxidation[J]．Int J Oral Maxillofac Implants, 2010,25(1):130-136．
[15]Jemat A,Ghazali MJ,et al．Surface Modifications and Their Effects on Titanium Dental Implants.[J]．2015, 12( 1):220-226.
[16] 石凯丽．铅对儿童骨代谢的影响机制[J]．国外医学:儿科学分册, 2002, 29(6)：289-291．
[17] Zhang H, Wu W．Adjacent Lone Pair (ALP) Effect: A Computational Approach for Its Origin[J]．Chemistry, 2016 25(1):230-236．
[18] Postiglione L, Di Domenico G, Ramaglia L, et al. Behavior of SaOS-2 cells cultured on different Titanium surfaces[J]. J Dent Res, 2003, 82(9): 692-696.
[19] Qu J, Lu X, Li D, et al．Silver/hydroxyapatite composite coatings on porous titanium surfaces by sol-gel method [J]．J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2011,97(1):40-48．
[20] Cai XY, Li NN．Biomimetic anchors applied to the host-guest antifouling functionalization of titanium substrates[J]．J Colloid Interface Sci, 2016，21(4):8-16.
[21] Baranowski A, Klein A, et al．Surface Functionalization of Orthopedic Titanium Implants with Bone Sialoprotein[J]．PLoS One, 2016,11(4):4-15.
Effects of microarc oxidation on adhesion, proliferation and cell activity of osteoblasts on pure titanium surface
MAMinxian1,ZHOUZheng,WANGYong,YANGJing,ZHANGJunbiao,LIUQin,WANGMei
(1AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)
Objective To observe the effects of microarc oxidation (MAO) on the adhesion, proliferation and ALP activity of osteoblasts on pure titanium surface.MethodsNinety samples of pure titanium were divided into three groups: the observation group, control group and the blank group, 30 in each group. The observation group and control group were treated by MAO and hydrogen peroxide, and the blank group was pure titanium. The titanium surface was coated in 100 μL cell suspension of osteoblasts in the logarithmic phase. On day 1, 2, 3, 6, 7 and 8, the blood counting chamber was used to count the number of osteoblasts adhering on the surface of the titanium plate, and MTT was used to determine the cell proliferation rate on day 1, 2, 3 and 6 in each group, and alkaline phosphatase was used to detect the ALP activity on day 3 and 6.ResultsOn day 3, 6, 7 and 8, the number of osteoblasts adhering on the surface of the titanium plate: the observation group>the control group> the blank group, allP<0.05. The cell proliferation rate on day 3 and 6: the observation group
osteoblasts; microarc oxidation; pure titanium; biocompatibility; alkaline phosphatase
贵州省科学技术基金资助项目(黔省专合-2010-83号)。
马敏先(1971-)，男，硕士，副主任医师，主要研究方向为口腔种植及修复的临床教学及科研。E-mail： 156722229@qq.com
10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.008
R783
A
1002-266X(2016)18-0025-04
2015-09-24)
