4′，5，7-三羟基异黄酮对LPS诱导的人主动脉内皮细胞ephrinB2及IL-6 mRNA表达的影响*

姜　念，周雪冰，欧刚卫，陆红玲（遵义医学院，贵州遵义563000）

4′，5，7-三羟基异黄酮对LPS诱导的人主动脉内皮细胞ephrinB2及IL-6 mRNA表达的影响*

姜念，周雪冰，欧刚卫，陆红玲△
（遵义医学院，贵州遵义563000）

目的探讨4′，5，7-三羟基异黄酮对脂多糖（LPS）诱导人主动脉内皮细胞（HAEC）标记物ephrinB2及炎症因子白介素-6（IL-6）mRNA表达的影响。方法体外培养HAEC，分别用浓度为0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL的LPS刺激HAEC 4 h，建立HAEC损伤模型。将培养的人主动脉内皮细胞分为模型组（LPS 0.1 μg/mL），对照组，4′，5，7-三羟基异黄酮低（1.0 μm/mL）、中（10.0 μm/mL）、高（100.0 μm/mL）浓度组。MTT法检测细胞的活力，Real-time PCR法检测HAEC ephrinB2及IL-6 mRNA表达情况。结果除10.0、100.0 μg/L LPS组外，其余各浓度组与对照组比较，均能使HAEC的活力降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；LPS能促进ephrinB2及IL-6 mRNA的表达；4′，5，7-三羟基异黄酮中、高浓度组可促进HAEC细胞活力增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；4′，5，7-三羟基异黄酮低、中浓度组可明显降低ephrinB2及IL-6 mRNA的表达，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论适当浓度的4′，5，7-三羟基异黄酮对LPS诱导的HAEC损伤有一定的保护作用。

异黄酮类；内皮细胞；白细胞介素6；脂多糖类；细胞增殖；炎症；ephrinB2

许多研究发现，动脉粥样硬化（AS）具有变质、渗出及增生等炎症特征，因此，炎症因子在心脑血管疾病的发生、发展及预后判断中起着极其重要的作用［1］。其中白介素6（IL-6）在AS中是一种具有较强独立预测价值的炎症标志物，在AS早期阶段，IL-6在血管损伤过程中起着重要作用［2-3］。ephrinB2是内皮细胞的标记物之一，与内皮细胞增殖、迁移、黏附及分化等过程密切相关，在早期的血管重塑中很重要。4′，5，7-三羟基异黄酮又名染料木素、金雀异黄素，是黄酮类化合物中的一种，已发现其具有明显的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血脂及保护血管内皮细胞等生物活性［4-5］，但其具体作用机制目前仍不十分明了。本研究以脂多糖（LPS）作用人主动脉内皮细胞（HAEC），探讨4′，5，7-三羟基异黄酮对HAEC ephrinB2 及IL-6mRNA表达的影响，旨在为进一步阐明4′，5，7-三羟基异黄酮对内皮细胞的保护机制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂与细胞株HAEC（美国模式菌种收集中心，即ATCC），4′，5，7-三羟基异黄酮、LPS、胰酶（Hyclone公司），MTT、RPMI1640培养液、胎牛血清（FBS，Gibco公司）。

1.2方法

1.2.1HAEC培养用含1%双抗、10%FBS的RPMI 1640培养基在37℃、5%CO2条件下培养HAEC。

1.2.2建立HAEC损伤模型将HAEC传代培养，生长融合成单层细胞，采用胰酶消化并进行细胞计数后接种于96孔板（每孔2×104个细胞），24 h后倾去培养液，用PBS洗 2～3遍。细胞分组：（1）对照组；（2）不同浓度LPS组：0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL。刺激各组细胞4 h，弃培养基后用PBS润洗2次，加180 μL无血清培养基和20 μL MTT培养4 h，弃去培养基加150 μL DMSO振荡20 s，于酶标仪490 nm处读取各组OD值。实验重复3次，取平均值。

1.2.3MTT法检测4′，5，7-三羟基异黄酮对LPS损伤HAEC活力的影响细胞培养及接种同1.2.1、1.2.2，将细胞分为对照组、模型组（LPS 0.1 μg/mL）、4′，5，7-三羟基异黄酮低（1.0 μmol/mL，GL）、中（10.0 μmol/mL，GM）、高（100.0 μmol/mL，GH）浓度组。将不同浓度的4′，5，7-三羟基异黄酮与 HAEC孵育 30 min后，加入 LPS （0.1 μg/mL）作用细胞4 h，弃培养基后用PBS润洗2次，加180 μL无血清培养基和20 μL MTT培养4 h，弃去培养基加150 μL DMSO振荡20 s，于酶标仪490 nm处读取各组OD值。实验重复3次，取平均值。

1.2.4Real-time PCR检测HAEC ephrinB2及IL-6 mRNA的表达细胞培养及分组同1.2.1、1.2.2。收集各组细胞，按Trizol试剂盒操作要求提取各组总RNA，按RT-PCR试剂盒操作进行逆转录，逆转录反应条件为37℃15min、85℃5 s、4℃。将扩增的cDNA加入至20 μL的反应体系。引物序列见表1。

表1　引物序列

PCR采用SYBR GREEN法，反应条件：95℃3 min、55℃10 s、60℃30 s，40个循环，然后65℃5s、95℃5 min。以β-actin作为内参基因，目的基因的表达根据经Real-time PCR仪器检测的Ct值，通过公式2-（△△Ct）进行相对定量分析，计算mRNA表达水平。

1.3统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组内比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1MTT法检测不同浓度LPS作用后HAEC活力HAEC经不同浓度LPS（0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0μg/mL）刺激4 h后，除10.0、100.0 μg/mL LPS组外，其余各浓度组与对照组比较，均能使HAEC的活力降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2MTT法检测4′，5，7-三羟基异黄酮对LPS损伤HAEC活力的影响模型组OD值与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。4′，5，7-三羟基异黄酮GM、GH组与模型组比较，反映细胞存活的OD值有明显上升，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2　MTT法检测不同浓度LPS作用后HAEC活力（±s）

表2　MTT法检测不同浓度LPS作用后HAEC活力（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05。

组别对照组0.1 μg/mL LPS组1.0 μg/mL LPS组10.0 μg/mL LPS组100.0 μg/mL LPS组1 000.0 μg/mL LPS组OD值0.173±0.015 0.117±0.030a0.116±0.024a0.170±0.001 0.138±0.020 0.101±0.012a

表3　MTT法检测4′，5，7-三羟基异黄酮对HAEC活力的影响（s）

表3　MTT法检测4′，5，7-三羟基异黄酮对HAEC活力的影响（s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

组别对照组模型组GL（1.0 μmol/mL）GM（10.0 μmol/mL）GH（100.0 μmol/mL）OD值0.479±0.034 0.374±0.059a0.398±0.016 0.447±0.049c0.439±0.006b

2.3Real-time PCR检测HAEC ephrinB2及IL-6 mRNA的表达与模型组比较，GL组HAEC ephrinB2 mRNA的表达降低，GM组对ephrinB2及IL-6 mRNA表达的抑制作用更明显，而GH组反而促进了HAEC ephrinB2、IL-6 mRNA的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4及图1。

表4　ephrinB2及IL-6 mRNA相对表达情况（±s）

表4　ephrinB2及IL-6 mRNA相对表达情况（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

组别对照组模型组GL（1.0 μmol/mL）GM（10.0 μmol/mL）GH（100.0 μmol/mL）ephrinB2 IL-6 1 1 2.509 8±0.253 3 0.886 4±0.101 1a0.067 6±0.001 9b2.815 0±0.388 9a1.360 0±0.226 2 1.224 0±0.220 6 0.985 0±0.049 4a1.650 0±0.155 5a

图1　ephrinB2及IL-6 mRNA的相对表达情况

3　讨　论

内皮细胞损伤是AS发生的早期阶段，受损内皮细胞表达特异性黏附受体及炎性相关细胞因子，吸引单核细胞聚集，黏附于内皮，引起慢性炎性反应，并不断摄取已进入内膜发生氧化的脂质，形成单核细胞源性泡沫细胞，从而引起AS的发生［6］。LPS是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，在慢性炎性反应过程中发挥重要作用。LPS的识别与跨膜信号转导是引起细胞炎症效应的关键，主要通过细胞膜Toll样受体4（TLR4）来实现［7］，其信号转导的经典途径是二者结合后，促进丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和IκB激酶家族（IκB kinases，IKKε）磷酸化，最终分别活化转录因子活化蛋白1（AP-1）和核因子κB （NF-κB），促进炎性反应因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β等的分泌，引发炎性反应。有研究表明，LPS直接损伤内皮细胞后，内皮细胞生物力学特性发生变化，LPS增加可使内皮细胞膜的黏度增加［8］。LPS可促进人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）、软骨细胞等增殖［9-10］。本研究结果发现，HAEC在受到不同浓度LPS作用时，随着LPS浓度的增加细胞活力逐渐降低，当LPS浓度达10.0 μg/mL时，细胞活力反而上升，但继续增加LPS浓度，细胞活力又逐渐降低；推测低浓度LPS对HAEC有损伤作用，而受到中浓度LPS作用时，LPS可诱导血管内皮细胞TLR4的表达［11］，经Toll样受体信号转导途径作用促进细胞增殖，而高浓度（1 000.0 μg/mL）LPS作用时对细胞可能产生毒性作用，从而使细胞活力降低。由于要观察4′，5，7-三羟基异黄酮的作用，本研究选取了能导致细胞损伤的有效LPS浓度（0.1 μg/mL）进行后续实验，结果表明，经不同浓度4′，5，7-三羟基异黄酮干预后，细胞活力逐渐增加，说明适当的4′，5，7-三羟基异黄酮浓度可以抑制内皮细胞的损伤。

IL-6是一种分布广泛的炎症细胞因子，可通过体液和细胞免疫过程影响炎症、介导宿主防御和组织损伤［12］。IL-6可作用于血管壁而引起其损伤，有研究表明，血管内损伤可使TNF-α释放增加，TNF-α又促进IL-6的释放增加［13］。本研究中，HAEC经LPS刺激4 h后IL-6 的mRNA表达增加，说明此时细胞受到了损伤。而内皮细胞功能的损害又是AS过程中的始动环节和关键环节［14］。ephrinB2是内皮细胞特异性生长因子，参与血管生成调控。ephrinB2与血管结构的稳定性关系密切，活化的ephrinB2主要表达在内皮细胞和周细胞交汇处，是两类细胞形成血管结构所必需的［15］。Steinle等［16］研究发现，用ephrinB2-Fc刺激正向信号会促进内皮细胞增殖和迁移。本研究结果显示，HAEC经LPS刺激后ephrinB2 mRNA表达增加，推测此时内皮细胞的功能发生了改变。4′，5，7-三羟基异黄酮作为一种植物雌激素，在食品、医药、化妆品、饲料等领域具有广泛的应用前景。Andrade等［17］研究发现，4′，5，7-三羟基异黄酮能降低LPS刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附力，进而表现出抗AS效应。本研究结果也显示，低、中浓度4′，5，7-三羟基异黄酮能明显抑制 ephrinB2及 IL-6 mRNA的表达，表明适当浓度的4′，5，7-三羟基异黄酮可以减轻LPS诱导的HAEC损伤。但高浓度的4′，5，7-三羟基异黄酮却反而表现出促进ephrinB2及IL-6 mRNA的表达，推测可能与其高浓度对细胞的毒性作用有关。杨龙等［18］研究表明，高浓度的4′，5，7-三羟基异黄酮能诱导人肺癌耐药细胞系A549/DDP超微结构破坏，使细胞发生凋亡甚至坏死。

综上所述，LPS可以促使HAEC损伤，使ephrinB2 及IL-6的mRNA的表达水平上升，经适当浓度的4′，5，7-三羟基异黄酮干预后，ephrinB2及IL-6 mRNA的表达明显减低，对LPS诱导的HAEC损伤起到一定的保护作用。

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Effects of 4′，5，7 trihydroxyisoflavone on mRNA expression of ephrinB2 and IL-6 induced by LPS in human aortic en-dothelial cells*

Jiang Nian，Zhou Xuebing，Ou Gangwei，Lu Hongling△（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo study the effects of 4′，5，7 trihydroxyisoflavone on mRNA expression of ephrinB2 and IL-6 in duced by LPS in human aortic endothelial cells（HAEC）.MethodsHuman aortic endothelial cells were cultured in vitro and 0.1，1.0，10.0，100.0，1000.0 μg/mL of LPS was to stimulate HAEC for 4 h.The HAEC injury model was established.Then the cultured HAEC were divided into the model group（0.1 μg/mL LPS），low，middle and high 4′，5，7 trihydroxyisoflavone concentra tion groups（1.0，10.0，100.0 μm/mL respectively）；the cell vitality was detected by MTT assay.The mRNA expressions of ephrinB2 and IL-6 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsExcept for the 10.0，100.0 μg/mL LPS groups，the rest other concentration groups all could reduce the vitality of HAEC compared with the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），LPS could promote the mRNA expression of ephrinB2 and IL-6；the middle and high concentration 4′，5，7 trihydroxyisoflavone groups HAEC could promote the increase of HAEC vitality with statistical difference （P＜0.05）and the low and middle concentration 4′，5，7 trihydroxyisoflavone groups could significantly reduce the mRNA expression of ephrinB2 and IL-6 with statistical difference（P＜0.01）.ConclusionAppropriate concentration of 4′，5，7 trihdroxyisoflavone has a certain protective effect to LPS induced HAEC injury.

Isoflavones；Endothelial cells；Interleukin-6；Lipopolysaccharides；Cell proliferation；Inflammation；ephrinB2

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.002

A

1009-5519（2016）07-0966-03

贵州省科技厅联合基金重点项目（黔科合J字LKZ［2013］14）。

姜念（1989-），在读硕士研究生，主要从事心血管疾病分子生物学研究。

△，E-mail：l_hongling2@163.com。

（2015-12-10）