主要环境及营养因素对西瓜枯萎病菌生长的影响

郭晓钰,　纪莉景,　王亚娇,　王翠霞,　孔令晓*

(1. 河北农业大学植保学院, 保定　071000; 2. 河北省农林科学院植物保护研究所, 河北省有害生物综合防治工程技术研究中心, 农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室, 保定　071000)



主要环境及营养因素对西瓜枯萎病菌生长的影响

郭晓钰1,2,纪莉景2,王亚娇2,王翠霞2,孔令晓2*

(1. 河北农业大学植保学院, 保定071000; 2. 河北省农林科学院植物保护研究所, 河北省有害生物综合防治工程技术研究中心, 农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室, 保定071000)

采用菌丝生长速率法和产孢量测定研究了不同温度、光照、pH及碳氮源对来源于海南、河北和上海的3株西瓜枯萎病菌Fo-HN-46、Fo-HB-12和Fo-SH-1生长速率和产孢量的影响。结果表明:西瓜枯萎病菌菌株的适宜生长温度为20～30℃,Fo-HN-46最适生长温度为28℃,Fo-HB-12和Fo-SH-1最适生长温度为25℃,产孢的最适温度为28～30℃;光照对西瓜枯萎病菌生长速率无显著影响,对产孢影响显著,Fo-HN-46在黑暗条件下单位面积产孢量最高,Fo-HB-12和Fo-SH-1在半光照条件下产孢量最高;pH对西瓜枯萎病菌菌株的生长速率和产孢量有显著影响,pH7～9时菌丝生长速率快,pH8～11时产孢量高;葡萄糖、淀粉和乳糖作为碳源能够显著增加西瓜枯萎病菌的产孢量;蛋白胨作为氮源能显著促进菌丝生长,硝酸钠、酵母粉和蛋白胨均能显著增加西瓜枯萎病菌的产孢量。用最适碳源、氮源培养,Fo-HN-46生长速率大于Fo-HB-12和Fo-SH-1。Fo-SH-1产孢量高于Fo-HN-46和Fo-HB-12。

西瓜枯萎病菌;菌丝生长速率;产孢量

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp. niveum)引起的土传病害[1],是导致西瓜产量和品质降低的最严重障碍之一[2]。我国每年西瓜枯萎病发生面积约为25万hm2,重茬地发病率一般在30%以上,严重地块达80%,甚至绝产[3]。我国西瓜种植区域的气候、土壤有很大差异,各个省区都有各自主栽的西瓜品种[4],因此西瓜枯萎病菌的种群多样性较为复杂,致病性存在较大变化。目前各省区关于西瓜枯萎病菌的生物学特性有较多报道,但是地理位置相距较远的西瓜枯萎病菌的生物学特性比较还鲜有报道。本试验对分离自海南、河北、上海三地区的西瓜枯萎病菌适宜生长和产孢的温度、光照、pH及碳氮源环境条件进行了研究,探讨与西瓜枯萎病的发生流行有关的因子,旨在为制定更为有效的西瓜枯萎病防治策略提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株

供试菌株来源详见表1。

表1　供试菌株及来源

1.1.2供试培养基

在温度、光照、pH对西瓜枯萎病菌生长的影响试验中,菌丝生长速率测定均采用PDA培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水1 000mL),产孢量测定采用PDB培养基;碳源、氮源对菌丝生长速率的影响试验,以Czapek培养基(硝酸钠3g,磷酸氢二钾1g,七水硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,硫酸亚铁0.01g,蔗糖30g,20g琼脂,蒸馏水1 000mL)为基础培养基,分别替换不同碳氮源,产孢量测定采用相应的液体培养基。

1.2试验方法

1.2.1菌种准备

提前在PDA平板上活化西瓜枯萎病菌菌株,在生长5d的菌落边缘,用直径为6mm的灭菌打孔器打出菌盘备用。将菌盘接种于PDB培养基,于摇床170r/min培养3d,制备种子液待用。

1.2.2温度对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

制备厚度一致、pH为7的PDA平板,菌丝面向下接种菌盘。设置5、10、15、20、23、25、28、30℃共8个温度处理,4次重复,半光照(光照强度2 000lx,L∥D=12h∥12h)条件下培养4d,十字交叉法测量菌落直径,计算生长速率;制备pH为7的PDB培养基,温度处理设置同上,每处理接种终浓度为2%的种子液,4次重复,在光照强度2 000lx,L∥D=12h∥12h条件下,170r/min摇床培养4d,血球计数板测定孢子数,计算产孢量。

1.2.3光照对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

将菌盘接种于厚度一致、pH为7的PDA平板上,设置全光照(2 000lx)、半光照、黑暗3种处理,4次重复,25℃培养4d,测定菌落生长速率;每皿中加入适量蒸馏水,刮取分生孢子并充分混匀,血球计数板法测定孢子数,计算单位面积产孢量。

1.2.4pH对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

配制pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共计10个处理的PDA培养基,接种菌盘,4次重复,在25℃、半光照条件下培养4d,测定生长速率;配制相应pH的PDB培养基测定产孢量,方法同1.2.2。

1.2.5碳源、氮源对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

采用Czapek培养基,以缺少碳源或氮源的Czapek培养基为对照,用等量的葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖分别置换其中的蔗糖,用硫酸铵、尿素、酵母粉、蛋白胨分别置换其中的硝酸钠,调节pH为 7,接种菌盘,4次重复,在25℃、光照强度2 000lx,L∥D=12h∥12h条件下培养4d,测定菌落生长速率;产孢量测定方法同1.2.2。

1.3计算公式及数据处理

生长速率(mm/d)=(菌落半径-3)/培养天数;

数据采用SPSS软件处理,Duncan新复极差法进行单因素方差分析。

2　结果与分析

2.1温度对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

温度对3个枯萎病菌菌株的生长速率均有显著影响(图1),各菌株在10℃以下均不生长,15℃时生长速率显著升高,在20～30℃时适宜生长,生长速率趋于平稳,为7.33～10.73mm/d。3个枯萎病菌菌株的最适生长温度不同,Fo-HN-46最适生长温度为28℃,Fo-HB-12和Fo-SH-1最适生长温度为25℃。比较相同温度下不同西瓜枯萎病菌菌丝生长速率可知,15℃时Fo-HN-46和Fo-HB-12的生长速率显著大于Fo-SH-1,其他温度条件下3菌株的生长速率无显著差异。

图1　温度对西瓜枯萎病菌生长速率的影响Fig.1　Effects of temperature on the mycelium growth rate of Fusarium oxysporum f.sp. niveum

从各菌株的产孢量(图2)看,温度对3株枯萎病菌菌株的产孢量均有显著影响,各菌株在10℃以下均不产孢,15℃时产孢量显著升高,产孢量均随温度升高而增加。3个菌株适宜产孢的温度范围不同,Fo-HN-46适宜产孢的温度范围为28～30℃,Fo-HB-12适宜产孢范围为25～30℃,Fo-SH-1适宜产孢范围为23～30℃。3个菌株均在30℃下产孢量达到最高,Fo-HB-12和Fo-SH-1在30℃下产孢量均显著升高,较在28℃的产孢量分别增加了1.9倍和0.97倍,而Fo-HN-46在30℃时产孢量增加不显著。比较同一温度下不同西瓜枯萎病菌的产孢量,发现3个菌株除在5℃、10℃和25℃产孢量无显著差异,在其他温度下产孢量均存在显著差异。温度为28℃、30℃时Fo-HB-12和Fo-SH-1产孢量均显著大于Fo-HN-46。

图2　温度对西瓜枯萎病菌的产孢量影响Fig.2　Effect of temperature on spore production of Fusarium oxysporum f.sp. niveum

2.2光照对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

在全光照、光照黑暗交替和全黑暗3个不同光照条件下培养上述3株西瓜枯萎病菌,生长速率和单位面积产孢量测定结果(表2)表明,光照对西瓜枯萎病菌的菌丝生长速率没有显著影响,对产孢量影响显著。Fo-HN-46在黑暗条件下单位面积产孢量最高,Fo-HB-12和Fo-SH-1在半光照的条件下产孢量最高。相同的光照条件下,3个菌株的产孢量有显著差异,Fo-HN-46的产孢量最大,其次是Fo-HB-12,Fo-SH-1在各光照处理下产孢量均最小。

表2　光照条件对西瓜枯萎病菌生长速率和产孢量的影响1)

1) 小写字母表示同一菌株在不同光照条件下生长速率或产孢量的差异显著性，大写字母表示在相同光照条件下不同菌株间生长速率或产孢量的差异显著性(P≤0.05)。

Lowercaselettersindicatesignificantdifferenceofthesamestrainunderdifferentlightconditions;thecapitallettersindicatethesignificantdifferenceofdifferentstrainsatthesamelightcondition(P≤0.05).

2.3pH对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

pH对各西瓜枯萎病菌的菌丝生长速率有显著影响，从图3可以看出，pH3～6时菌丝生长速率随pH增加而增加；当pH为7～9时，3个菌株的生长速率分别达到最高，菌株Fo-HN-46、Fo-HB-12、Fo-SH-1分别在pH7～9、pH8～ 9、pH10～13时的菌丝生长速率显著高于其他pH条件下；pH10～13下3个菌株的生长速率呈现下降趋势。比较相同pH下菌株之间的菌丝生长速率差异，结果显示，在pH3、4、6、8、9时，3个菌株的生长速率差异不显著，pH5～7时，菌株Fo-HN-46菌丝生长显著快于Fo-HB-12和Fo-SH-1，而pH10～13时，菌株Fo-HN-46菌丝生长显著慢于Fo-HB-12和Fo-SH-1。

pH对西瓜枯萎病菌各菌株产孢量有显著影响，菌株Fo-HN-46在pH10时的产孢量显著高于其他pH，菌株Fo-HB-12在pH8时的产孢量显著高于其他pH，菌株Fo-SH-1在pH9～11 的产孢量显著高于其他pH。在pH7～8时，3个菌株的产孢量无显著差异，而其他pH条件下，3个菌株产孢量均存在较大差异，碱性条件较适宜产孢(图4)。

图3　pH对西瓜枯萎病菌生长速率的影响Fig.3　Effect of pH value on the mycelium growth rate of Fusarium oxysporum f.sp. niveum

2.4碳源、氮源对西瓜枯萎病菌生长及产孢的影响

以Czapek培养基为基础培养基,缺少碳源、氮源为对照,设置不同碳源、氮源处理培养3株西瓜枯萎病菌。生长速率和产孢量测定结果表明,碳源对菌丝生长速率的影响较小,对产孢量影响显著。葡萄糖、淀粉和乳糖作为碳源能够显著增加3个菌株的产孢量,以葡萄糖对产孢量影响最为显著,葡萄糖为碳源时各菌株的产孢量均显著增加,其中Fo-HN-46较缺碳对照产孢量增加7.9倍,Fo-HB-12增加12.6倍,Fo-SH-1增加7.3倍。

图4　pH对西瓜枯萎病菌产孢量的影响Fig.4　Effect of pH value on spore production of Fusarium oxysporum f.sp. niveum

氮源对菌丝生长速率和产孢量均有显著影响,蛋白胨能显著促进菌丝生长,硝酸钠、酵母粉和蛋白胨均能够显著增加各菌株的产孢量。Fo-HN-46以蛋白胨为氮源时产孢量最高,较缺氮对照增加18.9倍;Fo-HB-12和Fo-SH-1以酵母粉为氮源时产孢量最高，较缺氮对照分别增加了26.6倍和13.9倍。而各菌株以硫酸铵为氮源时,产孢量均显著下降(表4)。

综合分析,碳源和氮源对西瓜枯萎菌产孢量的影响比对菌丝生长的影响大,氮源对西瓜枯萎菌产孢量的影响比碳源的影响大。Fo-HN-46用最适碳源、氮源培养,其菌丝生长速率大于Fo-HB-12和Fo-SH-1。Fo-SH-1用最适碳源、氮源培养,其产孢量高于Fo-HN-46和Fo-HB-12。

表3　不同碳源对西瓜枯萎病菌生长速率和产孢量的影响1)

1) 小写字母表示同一菌株在不同碳源下生长速率或产孢量的差异显著性,大写字母表示在相同碳源下不同菌株间生长速率或产孢量的差异显著性(P≤0.05)。

Lowercaselettersindicatethesignificantdifferenceofthesamestrainunderdifferentcarbonsources;thecapitallettersindicatethesignificantdifferenceofthedifferentstrainsatthesamecarbonsources(P≤0.05).

3　结论与讨论

尖孢镰刀菌西瓜专化型引起的西瓜枯萎病在我国各西瓜产区均有发生。本试验选用地理位置相距较远的海南、河北和上海三个地区的西瓜枯萎病菌,研究了温度、光照、pH及碳氮源对菌株生长和产孢的影响。结果发现,菌株Fo-HN-46、Fo-HB-12和Fo-SH-1的最适生长温度范围为25～28℃,与范鸿雁等人研究的海南、江苏和四川各地的菌株适宜生长温度基本一致[59];本研究发现菌株Fo-HN-46、Fo-HB-12和Fo-SH-1都是在半光照和黑暗条件适宜产孢,与范鸿雁的研究结果海南菌株在半光照条件下产孢量高[5]一致;pH对西瓜枯萎病菌生长的影响研究表明,3株菌株均在pH7～9的偏碱性条件最适生长,与范鸿雁、徐瑞福等人的研究结果基本一致[5,1011]。本研究还发现3株菌株最适产孢的pH为9～11,较菌丝生长适宜的pH范围偏碱,与前人研究相一致[1011]。比较3株菌株在相同pH下的产孢量,发现在pH为5、6时,海南菌株Fo-HN-46的产孢量显著高于河北菌株Fo-HB-12和上海菌株Fo-SH-1。这可能与海南省农田土壤为酸性总体pH水平为5.2,而河北和上海为中性偏碱的土壤,枯萎病菌对当地的土壤产生了一定的适应性有关[1214]。由上述结果可见,3株菌株最适培养条件均有一定差异,可能与各地区气候及土壤条件有关。

表4　不同氮源对西瓜枯萎病菌生长速率和产孢量的影响1)

1) 小写字母表示同一菌株在不同氮源下生长速率或产孢量的差异显著性,大写字母表示在相同氮源下不同菌株间生长速率或产孢量的差异显著性(P≤0.05)。

Lowercaselettersindicatethesignificantdifferenceofthesamestrainunderdifferentnitrogensources;thecapitallettersindicatethesignificantdifferenceofthedifferentstrainsatthesamenitrogensources(P≤0.05).

西瓜枯萎病菌在有机氮源下生长和产孢量要显著高于无机氮源,而有研究表明增施有机肥能够显著降低枯萎病的发生[15],因此说明有机肥中有其他抑制病原菌生长或侵染的物质存在,还需进一步研究病原菌产孢和病害发生的关系;本研究结果硫酸铵为氮源培养枯萎病菌时可显著降低菌株产孢量,与Ioannou等报道的硫酸铵与日光暴晒同时使用对西瓜枯萎病防治更加有效的结果一致[16]。由此可见,对西瓜枯萎病菌生长及产孢环境及营养条件的研究,对西瓜枯萎病的防治具有一定的指导作用。

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(责任编辑：杨明丽)

EffectsofmainenvironmentalandnutrientfactorsonthegrowthofdifferentFusarium oxysporumf.sp. niveumstrainsfromwatermelon

GuoXiaoyu1,2,JiLijing2,WangYajiao2,WangCuixia2,KongLingxiao2

(1.CollegeofPlantProtection,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China; 2.InstituteofPlantProtection,HebeiAcademyofAgriculturalandForestrySciences,IntegratedPestManagementCenterofHebeiProvince,KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinNorthernRegionofNorthChina,MinistryofAgriculture,Baoding071000,China)

Thisstudyaimstodeterminetheeffectsoftemperature,light,pHvalue,carbonandnitrogensourcesonthemycelialgrowthandsporeproductionofFusarium oxysporumf.sp. niveum (FON)fromwatermelon,whichwerecollectedfromwatermelonproductionareasofHainan,HebeiprovincesandShanghaiCity.Theresultsshowedthatthesuitabletemperatureformycelialgrowthandsporulationwere20-30℃and28-30℃,respectively.TheoptimumgrowthtemperatureforFo-HN-46was28℃.TheoptimumgrowthtemperatureforFo-HB-12andFo-SH-1was25℃.Thelighthadnosignificanteffectonmycelialgrowthofthepathogen,buthadsignificanteffectonsporulation.ThesporeyieldsperunitareaofFo-HN-46werehighestunderalldarknessconditions.ThesporeyieldperunitareaofFo-HB-12andFo-SH-1washighestunderalternationoflightanddarknessconditions.MyceliagrowthandsporeproductionofthedifferentFONstrainsweresignificantlyaffectedbydifferentpHvalues.ThemyceliumgrowthratesofthedifferentstrainsatpH7to9werefasterthanthatatanyotherpHvalues.ThesporeyieldsofthedifferentstrainsatpH8to11werefasterthanthatatanyotherpHvalues.Glucose,starch,andlactoseascarbonsourcecouldsignificantlyincreasethesporeproductionofF. oxysporum.Peptoneasnitrogensourcescouldpromotemycelialgrowth,whilesodiumnitrate,yeastextractandpeptonecouldsignificantlyincreasethesporeyieldofthepathogen.ThereweresignificantdifferencesinthemycelialgrowthandsporeproductionamongthedifferentF.oxysporumstrainswhentheoptimumcarbonsourceornitrogensourcewereused.ThemyceliumgrowthrateofFo-HN-46wasfasterthanthoseofFo-HB-12andFo-SH-1.ThesporeyieldofFo-SH-1washigherthanthoseoftheFo-HN-46andFo-HB-12.

pathogenofwatermelonfusariumwilt;myceliumgrowthrate;sporeyield

20150326

20150416

公益性行业(农业)科研专项(200903049)

E-mail:konglingxiao@sohu.com

S436.5

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.026