正交设计法优选石榴皮中总多酚的超声提取工艺*

陈　素，周文财，高雅媛，何　洋

(广东药学院医药化工学院，广东　中山　528458)



正交设计法优选石榴皮中总多酚的超声提取工艺*

陈素，周文财，高雅媛，何洋

(广东药学院医药化工学院，广东中山528458)

利用正交设计法优选石榴皮中总多酚的提取工艺。以没食子酸为对照，福林试剂为显色剂，用紫外-可见分光光度法在760 nm处测定总多酚的含量。采用L9(34)正交试验设计，以石榴皮中总多酚含量为考察指标，考察乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间4个因素对提取的影响。结果表明：最佳提取工艺为乙醇浓度为40%，提取温度55 ℃，料液比1:30，提取时间为30 min。该工艺经试验重复性好，操作简单，为石榴皮中总多酚的开发提供了参考依据。

石榴皮；总多酚；正交试验；紫外-可见分光光度法

石榴皮(Granatipericarpium)为石榴科植物石榴(PunicagratanumL.)的干燥果皮，收载于《中国药典》(2010年版)。秋季果皮成熟后收集果皮，晒干。性温，味酸、涩，归大肠经。有涩肠止泻、止血、驱虫的功效，用于久泻、久痢、便血等[1]。现代药理学研究表明石榴皮多酚具有抗氧化、消除自由基[2]，抗肿瘤[3]，抗病毒、抗菌及抗炎[4]，降血糖[5]等作用。本文研究石榴皮中总黄多酚成分的提取工艺，为科学开发和利用石榴皮提供可靠依据。

1　仪器与试药

1.1仪器

UV1102紫外可见分光光度计,上海天美科学仪器有限公司;KQ-500型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;CP225D型电子天平,德国Sartorius公司。

1.2药材与材料

没食子酸对照品(批号110831-201204)，购自中国食品药品检定研究院;石榴皮药材(20110701),河北楚冈中药饮片有限公司;试剂均为分析纯，超纯水实验室自制。

2　方法与结果

2.1石榴皮总多酚含量测定方法

2.1.1对照品溶液的的制备

取没食子酸对照品7 mg，精密称定，置50 mL容量瓶，加水适量，振摇使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液I，没食子酸浓度为0.1446 mg·mL-1。同法配制对照品储备液Ⅱ，没食子酸浓度为45.11 mg·mL-1。

2.1.2供试品溶液的制备

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精密称定，加40%乙醇溶液20 mL，50℃，超声提取30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加40%乙醇溶液溶解，转移至50 mL量瓶中，加40%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，至20 mL量瓶中，加40%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系考察

精密量取对照品储备液I0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加入蒸馏水10 mL，加入福林试剂0.5 mL，摇匀，在8 min内，再加入20%碳酸钠1.5 mL，摇匀，加入40%乙醇定容至刻度，摇匀，避光放置1.5 h，作为对照品系列溶液，以不含没食子酸的空白溶液为参比，于760 nm波长处测定吸光度，以对照品浓度(X)为横坐标，相应对照品吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=1.133×10-1X+6.400×10-3(r=0.9996)。试验表明，没食子酸在1.157～8.098 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2.2精密度试验

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，重复6次测定其吸光度，RSD为0.13%。结果表明，仪器精密度良好。

2.2.3稳定性试验

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h时，测定其吸光度，计算吸光度的RSD为0.62%。结果表明，样品室温放置2.5 h内稳定。

2.2.4重复性试验

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液6份，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，计算总多酚含量的平均值为185.0 mg·g-1，RSD为0.97%。结果表明，方法重复性良好。

2.2.5加样回收率试验

取已知含量的供试品粉末(总多酚的含量为183.9 mg·g-1)9份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入对照品储备液Ⅱ0.5、1.0和1.5 mL，按“2.1.2”项下方法操作，制备供试品溶液，每个浓度3份，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，计算总多酚的平均回收率为99.8%，RSD为1.2%，结果见表1。

表1　加样回收率试验结果(n=3)

2.3单因素考察方法

2.3.1乙醇浓度对提取的影响

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精确称定，5份，分别加入10%、20%、30%、40%和50%乙醇溶液，按“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，计算总多酚的含量。

结果表明，石榴皮总多酚提取含量随溶剂浓度增加而变化，其中30%乙醇溶液提取出的总多酚含量最佳。

2.3.2提取温度对提取的影响

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精确称定，5份，按“2.1.2”项下方法操作，提取温度分别设在50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃和70 ℃，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，计算总多酚的含量。

结果表明，随着提取温度的升高，石榴皮总多酚的提取率先增加而后下降，55 ℃为石榴皮总多酚最佳提取温度。

2.3.3料液比对提取的影响

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精确称定，5份，分别加入40%乙醇溶液15 mL、20 mL、25 mL、30 mL和35 mL，其余操作按“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，计算总多酚的含量。

结果表明，料液比对石榴皮总多酚的提取效率的影响随着提取溶剂体积的增加而下降，在1:30为石榴皮总多酚最佳提取料液比。

2.3.4提取时间对提取的影响

取石榴皮粉末(过三号筛)0.5 g，精确称定，5份，加入40%乙醇溶液20 mL，分别超声提取20、30、40、50和60 min，其余操作按“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法操作，测定其吸光度，计算总多酚的含量。

结果表明，随着时间的延长，石榴皮总多酚的提取率逐渐增加，到40 min后无明显增加，故确定提取40 min为石榴皮总多酚的最佳提取时间。

2.4石榴皮总多酚提取的正交试验

根据石榴皮总多酚的性质，考察了乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间4个因素，并结合以上单因素试验结果，设置4因素3水平正交试验(见表2)，根据因素水平表，以石榴皮总多酚含量为评价指标，按L9(34)正交表进行试验。正交试验数据处理采用正交试验直观分析法，统计不同水平下提取出石榴皮总多酚含量的平均含量，以极差R进行分析(见表3)。

表2　正交优选因素水平

表3　正交试验结果分析

极差R的结果表明，乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间4因素对石榴皮总多酚提取含量的影响的显著性为：料液比>乙醇浓度>提取温度>提取时间。石榴皮总多酚超声提取的最优水平搭配为A3B2C1D1，即乙醇浓度为40%，提取温度55 ℃，料液比1:30，提取时间为30 min为最佳提取工艺。

3　讨　论

最大吸收波长选择：取对照品溶液经显色处理后，以不含没食子酸的空白溶液为参比，将待测液盛于比色皿中，置于比色池中，在200～800 nm波长段扫描测定最大吸收度，结果显示，对照品及供试品均在760 nm处有最大吸收，故选择760 nm为测定波长。

4　结　论

正交优选石榴皮总多酚超声提取最佳提取工艺为乙醇浓度为40%，提取温度55 ℃，料液比1:30，提取时间为30 min。该方法优选出的工艺简单，重复性好，稳定性佳，操作容易。在实际生产中，也要考虑实际操作，溶剂消耗，浓缩回收溶剂的耗能等因素，调整工艺。

[1]中华人民共和国国家药典委员会．中国药典[S]．北京：中国医药科技出版社，2010:87．

[2]李建科,李国秀,赵艳红,等．石榴皮多酚组成分析及其抗氧化活性[J]．中国农业科学，2009,42(11):4035．

[3]Settheetham W，Ishida T．Study of genotoxic effects of antidiarrheal medicinal herbs on human cells in vitro[J]．Southeast Asian J Trop Med Public Health，1995，26(Suppl1):306．

[4]Nonaka G，Nishioka I，Nishizawa M，et al．Anti-AIDS agents，2：Inhibitory effects of tannins on HIV reverse transcriptase and HIV replication in H9 lymphocyte cells[J]．J Nat Prod，1990，53(3):587．

[5]姚海,王烨,徐永华,等．石榴皮乙酸乙酯提取物对胰岛细胞生长活力的影响[J]．新疆医科大学学报，2010,33(10):1168．

Study on Extraction Technology of Total Polyphenols inPunicagratanumL. by Orthogonal Design*

CHENSu，ZHOUWen-cai，GAOYa-yuan，HEYang

(School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Guangdong Zhongshan 528458，China)

The extraction technology of total polyphenols inpunicagratanumL. was optimized. The ultraviolet spectrophotometry method was used to measure the total polyphenols content in ethanol extract ofPunicagratanumL. with different polar solvent extraction, with Folin’s reagent as color reagent and the gallic acid as standard substance and the maximum absorption wave-length of 760 nm. By L9(34) orthogonal experimental design, withPunicagratanumL., as index of total polyphenols, ethanol concentration, extraction temperature, extraction time and ethanol dosage on the extraction were investigated. Results showed that the optimum extraction process was 40% ethanol, 55 ℃, 30 times the amount of reflux extraction and 30 min. The experimental reproducibility of the process showed the further development of process a better reference value.

PunicagratanumL.; total polyphenols; orthogonal experiment; UV-Vis spectrophotometry

广东药学院2014年省级大学生创新创业训练计划项目(项目编号: 201410573031)。

陈素(1993-)，女，在读本科，应用化学(化妆品科学与技术方向)。

何洋(1980-)，女，高级实验师，从事药品质量标准与药动学研究。

O657

A

1001-9677(2016)02-0060-03