怀牛膝多糖结合游泳训练对肝再生大鼠骨髓增殖的影响

杨军英，林金艳

(河南师范大学体育学院,河南新乡　453007)



怀牛膝多糖结合游泳训练对肝再生大鼠骨髓增殖的影响

杨军英，林金艳

(河南师范大学体育学院,河南新乡453007)

为了探讨牛膝多糖(Achyranthes bidentatapolysaccharides，ABPS)结合耐力训练对部分肝切除(Partialhepatectomy，PH)大鼠骨髓增殖的影响，对经过28d游泳训练(Swimmingtraining，ST)、灌胃ABPS的大鼠行2/3 部分肝切除手术，观察术后大鼠的运动能力和骨髓细胞的形态和增殖情况.结果表明，游泳训练能够明显延长正常大鼠的游泳运动致力竭时间(P<0.01)，降低骨髓细胞PCNA(Proliferatingcellnuclearantigen)的表达.ABPS结合游泳训练能够明显延长PH大鼠的游泳致力竭时间(和PH+ST对比， P<0.01)，使骨髓增生程度更活跃，有核细胞数增多，红细胞数量减少，促进了骨髓细胞PCNA的表达(和PH相比， P<0.01)，使G2/M期和S期细胞均明显减少，G0/G1期增多(P<0.05).提示牛膝多糖结合耐力训练增强了大鼠在肝脏部分切除手术后的运动能力，逆转了耐力训练对骨髓细胞增殖的抑制作用.

大鼠;牛膝多糖;游泳训练;骨髓细胞;增殖细胞核抗原

怀牛膝是常用的大宗中药材，是享有盛誉的“四大怀药”之一，具有“补肝肾，强筋骨”的功效.怀牛膝因其“引血下行”的特点而长于补益肝肾，强腰膝，用于寒湿痿痹、四肢拘挛，膝痛不可屈伸等骨、关节疾病的治疗.作为牛膝的主要药效成分，牛膝多糖(Achyranthes bidentatapolysaccharides，ABPS)具有促进软骨修复[1]、防治骨关节炎、保护肝脏[2]、延缓衰老、调节机体免疫力等功效[3]，具有广阔的药物开发及应用前景.研究表明ABPS能够增强动物的抗氧化酶活性和免疫功能[4]，对大鼠的肝脏再生具有促进作用[5-6].为了研究ABPS对骨髓增殖的影响，本研究采用大鼠 2/3 肝切除模型，探讨怀牛膝多糖结合游泳训练对大鼠骨髓增殖的作用，为牛膝的开发应用提供实验资料.

1　材料和方法

1.1仪器与试剂

流动水动物游泳池、KD-202型轮转式切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)、Eclipse80i显微镜(Nikon公司)、光学显微镜(Nikon公司)、流式细胞仪(BD公司)、低温高速离心机等.

怀牛膝采自河南温县，由河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心李金亭博士鉴定并提供.药材粉粹、煎煮、过滤后，按照文献[7]方法制备怀牛膝多糖(ABPS)，纯度为51%.以PBS配制成10mg·mL-1，高压灭菌后备用.

PCNA一抗(Santa公司)，羊抗小鼠IgG-Biotin二抗(武汉博士德生物技术有限责任公司)，辣根酶标记链霉亲和素(Horseradishperoxidasestreptavidiv，Vector公司)，BSA封闭液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB酶底物显色剂(北京索莱宝科技有限公司)、碘化丙啶(Propidiumiodide，Sigma公司)、RNA酶(上海生工生物工程有限公司)等.

1.2实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠70只，体重180～220g，由河南师范大学实验动物中心提供.自由饮水、摄食，常规饲养.

1.3方法

1.3.1动物分组和给药Wistar大鼠在实验室适应性饲养7d后，参照文献[8]方法进行适应性游泳运动筛检，筛选出60只参与实验.大鼠按称重随机分为6组，分别为对照组(Sedentarycontrol，SC)、游泳训练组(Swimmingexercisetraining，ST)、部分肝切除组(Partialhepatectomy，PH)、部分肝切除+游泳训练组(Partialhepatectomy+swimmingtraining，PH+ST)、游泳训练+牛膝多糖低剂量组(Swimmingtraining+ABPS2g·Kg-1·d-1，ST+ABPS2)、游泳训练+牛膝多糖高剂量组(Swimmingtraining+ABPS4g·Kg-1·d-1，ST+ABPS4)，每组10只.ST+ABPS2和ST+ABPS4组大鼠每次上午训练开始前1h灌胃给予相应剂量ABPS，其余大鼠给予等量PBS.手术当日和术后给药不间断.

1.3.2训练方案除SC和PH两组大鼠外，其余大鼠均进行游泳训练.游泳池水深60cm，水温(32±2)℃，水流量为4m3·h-1.训练周期为每周5d，每天2次.训练28d后对大鼠进行部分肝切除手术，术后96h开始连续训练3d.训练强度见表1.

1.3.3大鼠2/3肝切除模型制备参照Higgins等文献[9]方法，对大鼠(除SC和ST组之外的所有大鼠)进行2/3 肝切除手术.无菌切除肝左叶和中叶后，缝合切口，于上述饲养条件下分笼饲养.

1.3.4运动能力第6周第1d给药后 1h，检测大鼠负重(5% 体重)力竭游泳时间来评价大鼠的运动能力.以大鼠沉入水面下 3 次，每次 20s不能自行浮出水面，四肢运动不协调作为力竭标准，记录大鼠力竭时间.

1.3.5大鼠骨髓细胞增生度和形态学观察脱颈处死大鼠，解剖、分离其右后侧股骨，剖开骨髓腔，暴露出红色的骨髓组织，制备印片.每个样品重复 3 次，室温自然晾干.用吉姆萨-瑞氏混合染液静置染色 20min，中性树胶封片.在低倍镜下观察有核细胞与成熟红细胞的比例，判断骨髓细胞的增生度，在高倍镜下进行骨髓细胞形态学观察.

表1　大鼠游泳训练方案

1.3.6大鼠骨髓细胞PCNA的表达分离大鼠左后侧股骨，打开两侧干骺端，用RPMI-l640 培养基冲出骨髓细胞，过 400 目细胞筛后获得单细胞悬液.单细胞悬液用4%多聚甲醛固定后涂片，用细胞免疫化学方法进行染色.DAB显色，苏木素复染后，进行脱水、透明后中性树胶封片，镜检.统计每张切片 3 个视野的阳性细胞率，计算PCNA表达的百分比.

1.3.7大鼠骨髓细胞的细胞周期取骨髓单细胞悬液，用密度梯度离心法获得单个核细胞.台盼蓝染色检测细胞活性.取细胞活性≥95%的单个核细胞，用PBS调整细胞浓度至5×105～1×106个·mL-1，用冰冻无水乙醇固定细胞，-20 ℃ 冻存备用.

取固定的骨髓单个核细胞样品，用PBS洗涤除去无水乙醇，用碘化丙锭复合染液避光染色30min后，上流式细胞仪检测细胞周期.

1.3.8数据分析实验数据用SPASS做统计分析，以均值±标准差表示，P<0.05为差异显著.

2　结果

2.1ABPS结合游泳训练增强PH大鼠的运动能力

负重游泳能够直观的检测药物制剂抗疲劳的效果.实验结果(图1)表明，游泳训练能够明显延长正常大鼠的力竭时间(和SC对比，P<0.01)，PH降低了SC大鼠和ST大鼠的运动能力(分别和SC，ST对比，P<0.05，P<0.01).ABPS结合游泳运动能够明显延长PH大鼠的游泳运动致力竭时间(和PH+ST对比，P<0.01)，增强其运动能力.结果提示，ABPS结合游泳运动能够缩短手术损伤后运动能力的恢复时间.

图1　ABPS 结合耐力训练对 PH大鼠运动能力的影响

与SC相比，**P<0.01；与ST比较，##P<0.01； 与ST+PH比较， △P<0.05，△△P<0.01

ComparedtoPH,**P<0.01；comparedtoST,##P<0.01；comparedtoST+PH, △P<0.05,△△P<0.01

2.2ABPS结合游泳训练刺激PH大鼠的骨髓增生

本研究直接用骨髓印片，更好地保持了骨髓细胞的形态，真实地反映了骨髓细胞在体内的实际增生情况.SC和ST大鼠的骨髓腔充盈，呈红色.PH大鼠骨髓腔组织略疏松，颜色浅.骨髓细胞染色常采用吉姆萨-瑞氏混合染色法，综合吉姆萨染色和瑞氏染色法的优势，将血红蛋白、嗜酸性颗粒等嗜酸性物质染成淡粉红色，细胞核蛋白和淋巴细胞等嗜碱性物质染成蓝紫色，中性颗粒染成浅紫色.吉-瑞染色法使细胞核、细胞质和胞内颗粒着色鲜艳，对比鲜明.

从图2可以看出骨髓细胞的分类和有核细胞的增生程度，SC和ST组骨髓增生活跃，PH组大鼠骨髓增生明显活跃，有核细胞数目变化不明显，成熟红细胞较少.与PH组相比，PH+ST组没有明显变化，而ST+ABPS组大鼠的骨髓增生程度更活跃，有核细胞数增多，红细胞数量略少.

图2　ABPS 结合游泳训练对 PH大鼠骨髓细胞形态的影响

A-F分别指SC、ST、PH、ST+PH、ST+ABPS2 和ST+ABPS4 组

A-FrepresentthegroupsofSC,ST,PH,ST+PH,ST+ABPS2andST+ABPS4respectively

2.3ABPS结合游泳训练刺激PH大鼠的骨髓细胞增殖

PCNA是DNA合成不可或缺的因子，其表达与细胞增殖周期有关，是判断细胞增殖活性的标志物之一.如图 3示，和SC相比，游泳训练导致PCNA表达降低(P<0.01)，ST+ABPS4 促进了其表达(P<0.05).游泳训练补充ABPS增强了PH大鼠骨髓细胞PCNA的表达(和PH相比，P<0.01).ST+ABPS4PCNA的表达明显增强(P<0.01).提示游泳训练降低了大鼠骨髓细胞增殖，PH后骨髓增殖激活，ABPS结合游泳训练可以逆转游泳训练导致的骨髓抑制.

图3　ABPS 结合游泳训练对PH大鼠骨髓细胞PCNA表达的影响

与SC比较，*P<0.05， ** P<0.01； 与ST比较，##P<0.01； 与ST+PH比较， △P<0.01.

ComparedtoSC, *P<0.05， **P<0.01；comparedtoST, #P<0.01；comparedtoST+PH, △P<0.01

2.4ABPS结合游泳训练对PH大鼠骨髓细胞增殖周期的影响

大鼠2/3肝切除刺激骨髓细胞增殖(图4).和SC相比，PH组大鼠骨髓细胞聚集在G2/M期，G0/G1期细胞减少(P<0.05).ST+PH和ST+ABPS组G2/M期细胞均明显多于SC组(P<0.05).相比ST组，PH组G0/G1期细胞明显减少(P<0.05)，G2/M期细胞明显增多(P<0.05).ST+ABPS则诱导骨髓细胞聚集在G0/G1期(P<0.05)，G2/M期和S期细胞均明显减少(P<0.05).

3　讨论

肝脏在不同损伤情况下，存在肝细胞再生和肝祖细胞再生两种不同的再生形式[10].随着对干细胞认识的深入，证明了骨髓造血干细胞可以横向分化为肝脏细胞，表明骨髓来源的干细胞参与了肝脏再生[11]，骨髓与肝再生的关系也受到了关注.当肝脏受损时，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在干细胞因子和基质细胞因子-α刺激下，随血液循环聚集到肝脏的损伤部位.肝脏损伤启动了特定的肝再生微环境，刺激BMSCs增殖、分化、转分化成为肝细胞，并完成整个肝再生[12].本研究前期实验结果表明，ABPS结合游泳训练能够促进PH大鼠肝脏再生.同时，ABPS结合游泳训练能够明显增强PH大鼠的运动能力.

图4　ABPS 结合游泳训练对PH大鼠骨髓细胞周期的影响

与SC相比，*P<0.05；与ST比较， #P<0.05； 与PH比较， △P<0.05

ComparedtoSC, *P<0.05；comparedtoST, #P<0.05；comparedtoPH, △P<0.05

动物实验研究表明，ABPS通过免疫刺激作用，具有抗肿瘤、抗衰老等作用.ABPS能增强正常和环磷酰胺致免疫低下小鼠外周血中NK细胞和TNF活性[4]，通过启动和活化巨噬细胞，纠正老年鼠的免疫低下状态[13].牛膝多糖等[5-6]通过促进肝细胞再生和修复等保护肝细胞，调节动物的细胞免疫和体液免疫，增强抗氧化酶活性等，对部分肝切除导致的肝损伤具有保护作用.牛膝多糖+游泳训练对游泳训练大鼠Th1和Th2型细胞平衡有一定的调节作用，能够预防免疫能力的下降[7].本研究通过4周游泳训练结合牛膝多糖处理，探讨大鼠骨髓细胞的增殖情况，发现ABPS结合游泳训练使大鼠的运动能力增强，这和周丽丽等的报道一致[8]，使大鼠骨髓增生程度更活跃，有核细胞数增多，红细胞数量略少，促进了骨髓细胞PCNA的表达，诱导骨髓细胞聚集在G0/G1 期，G2/M期和S期细胞均明显减少，逆转了游泳训练导致的骨髓抑制.

综上所述，怀牛膝多糖结合游泳训练能够提高PH术后大鼠的运动能力，逆转耐力游泳训练导致的骨髓抑制.此研究结果对牛膝多糖在肝损伤后运动能力和骨髓增殖方面的应用提供了基础.

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(责任编辑俞诗源)

EffectofABPScombinedwithswimmingtrainingontheproliferationofbonemarrowcellsinratsafterpartialhepatectomy

YANG Jun-ying,LIN Jin-yan

(School of Physical Education,Henan Normal University,Xinxiang 453007,Henan,China)

InordertoinvestigatetheeffectofABPScombinedwithswimmingtrainingontheproliferationofbonemarrowcellsinratsafterpartialhepatectomy,theadultwistarratsareperformedwith2/3partialhepatectomyafter4weeksswimmingtrainingcombinedwith2and4g·kg-1·d-1ABPS，thentheathleticabilityandthemorphologyandproliferationofthebonemarrowcellsareobserved.Theresultsshowthattheswimmingtrainingcouldprolongtheswimmingtimetoexhaustremarkably(P<0.01),decreasedtheexpressionofPCNA.ABPScombinedSTcouldalsoprolongexhaustivetime(comparedtoPH+STgroup,P<0.01),theresultofWright-Giemsastainshowmoreaccuratelyofbonecellshyperplasia,morekaryocytesandlowerRBC,enhancedthePCNAexpression(comparedwithPHgroup，P<0.01),andinducebonemarrowcellgatheredinG0/G1,decreasethecellsinG2/MandSphase(P<0.05).AndnoremarkabledifferenceofmorphologyandhistologyisfoundbetweentheABPS+STandSC(sedentarycontrol)group.ItimplysthatABPScombinedwithSTcanimprovetheathleticabilityofPHrat,withstoodtheinhibitionofproliferationofbonemarrowcellsinducedbyST.

achyranthesbidentatapolysaccharides;swimmingtraining;bonemarrowcells;proliferatingcellnuclearantigen

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.04.017

2016-03-10;修改稿收到日期:2016-04-25

新乡市科技发展规划资助项目(15SF04)

杨军英(1971—)，女，陕西宝鸡人，副教授,博士.主要研究方向为运动损伤与康复.

E-mail:041146@htu.cn

S131.2

A

1001-988Ⅹ(2016)04-0078-05