复合致病因素诱导肝硬化大鼠TGF-α和TGF-β1的动态变化*

田小霞， 张慧英△， 王黎敏， 李旭炯， 刘　燕， 张丽丽， 毕杨辉

(1. 长治医学院病理生理学教研室， 2. 机能综合实验室， 3. 生理学教研室， 山西 长治 046000)



复合致病因素诱导肝硬化大鼠TGF-α和TGF-β1的动态变化*

田小霞1， 张慧英1△， 王黎敏2， 李旭炯3， 刘燕3， 张丽丽1， 毕杨辉

(1. 长治医学院病理生理学教研室， 2. 机能综合实验室， 3. 生理学教研室， 山西 长治 046000)

目的：观察复合致病因素诱导肝硬化大鼠肝组织中转化生长因子-α(TGF-α)和转化生长因子-β1 (TGF-β1)的动态变化。方法：采用复合致病因素法复制大鼠肝硬化模型：首次皮下注射CCl4原液(0.5 ml/100 g·w)，之后每隔3天皮下注射40% CCl4油溶液(0.3 ml /100 g·w)，同时辅以低胆碱、高胆固醇、高脂肪、高醇饮食。随机将大鼠分为肝硬化模型4周、6周和8周组，并分别设立同期正常对照组。检测各组大鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)、内毒素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和同型半胱氨酸(Hcy)的水平；肝组织切片行HE染色，TGF-α和TGF-β1的免疫组化染色。结果：与相应的同期正常对照组比较，大鼠血浆中ALT、内毒素、TNF-α和Hcy水平在肝硬化模型4周、6周和8周组均逐渐显著升高(P<0.05)；肝组织中TGF-α的表达在肝硬化模型4周组明显增加(P<0.05)，而肝组织中TGF-β1的表达则随着肝硬化病程的进展持续显著增加(P<0.05)。结论：在肝硬化形成过程中，TGF-α的表达先增加后被抑制，TGF-β1的表达持续增加，导致肝细胞再生先增强后被抑制，而肝纤维化程度不断加重，最终发生肝硬化。TGF-α和TGF-β1的这一特征性动态变化可能与内毒素血症、TNF-α水平增高以及高同型半胱氨酸血症有关。

肝硬化；肝再生；肝纤维化；TGF-α；TGF-β1；大鼠

肝脏在受到损伤或切除时具有强大的再生能力，肝再生包括肝细胞、非实质细胞和细胞外结构的再生。如果细胞外基质成分的生长与肝细胞的再生失平衡，即细胞外基质成分过度生长，而肝细胞再生受抑制，就会导致肝脏发生纤维化乃至硬化[1]。转化生长因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)参与肝再生的增殖、凋亡和纤维增生[2]，在维持受损肝脏再生平衡中发挥重要作用。在前期的实验中观察到与正常对照组相比，肝硬化模型8周组动物血浆和肝组织匀浆中TGF-α的含量无明显变化，而TGF-β1的含量明显升高[3]，提示TGF-α和TGF-β1的失平衡在影响肝脏疾病走向中起作用。本次实验以复合致病因素诱导的肝硬化大鼠为研究对象，观察肝组织中TGF-α和TGF-β1在模型4周，6周和8周的动态变化，并初步探讨影响这一变化的可能机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂

CCl4(分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司；胆固醇购自天津市化学试剂公司；谷丙转氨酶(alanine transferase，ALT)、内毒素、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的ELISA检测试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司；兔抗大鼠TGF-α多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化染色SP检测试剂盒和二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；市售品牌白酒；市售玉米面和猪油。

1.2实验动物分组及标本制备

健康雄性SD大鼠36只，清洁级，体重180～220 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。随机将大鼠分为肝硬化模型组和正常对照组。肝硬化模型组动物采用复合致病因素法复制[4]：以掺入胆固醇(饲料重量0.5%)的玉米面做饲料，前2周掺入猪油(饲料重量20%)，首次皮下注射CCl4原液(0.5 ml/100 g·w)，之后每隔3天皮下注射40% CCl4油溶液(0.3 ml/100 g·w)，以4%(体积比)乙醇作为饮用水。正常对照组动物饲以标准饲料和矿物质饮用水。

将肝硬化模型组动物和正常对照组动物随机分为三批，分别于造模第4周末、6周末和8周末，全麻、无菌、无内毒素条件下取材。腹主动脉采集血液，3 000 r/min离心15 min后，吸取血浆，置-80℃保存备用；每次取肝脏同一区域组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，组织切片用于HE染色和免疫组化染色。

1.3血浆中指标检测

严格按照ELISA试剂盒操作说明，分别测定血浆中ALT、内毒素、TNF-α和Hcy水平。

1.4肝组织病理学

以石蜡包埋的肝组织标本制备4 μm厚连续切片，行HE染色，光学显微镜下观察病理学改变。

1.5肝组织免疫组化染色及结果判断

采用免疫组化SP法检测肝组织中TGF-α和TGF-β1蛋白表达情况。主要步骤：组织切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，分别滴加兔抗大鼠TGF-α (1∶300)和TGF-β1(1∶100)多克隆抗体，4℃冰箱孵育过夜，分别滴加生物素标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组化切片以有棕黄色颗粒为阳性表达，以不着色为阴性。采用Image pro plus医学图像分析系统对结果进行半定量分析，每张切片随即选取10个视野(×400)，分别计算阳性染色细胞占视野总细胞的百分数，取平均值进行统计学分析。

1.6统计学分析

2　结果

2.1血浆中ALT、内毒素、TNF-α和Hcy水平变化

与相应的同期正常对照组相比，大鼠血浆中ALT、内毒素、TNF-α和Hcy水平在肝硬化模型4周、6周和8周组均显著升高(P<0.05)，8周组显著高于4周组(P<0.05)，8周组Hcy水平也显著高于6周组(P<0.05，表1)。

Tab.

ALT：Alanine transferase; TNF-α：Tumor necrosis factor-α; Hcy: Homocysteine

*P<0.05vscontrol at the same time；?#P<0.05vsmodel 4thweek；?△P<0.05vsmodel 6thweek

2.2肝组织病理学改变

各正常对照组：肝小叶结构规整，肝细胞索排列整齐，板间可见不规则肝窦。肝硬化模型4周组：损伤呈区域性分布，肝细胞脂肪变性明显，肝细胞索排列紊乱；模型6周组：损伤区域较4周组明显扩大，部分区域小叶结构消失，可见增生的条索状纤维；模型8周组：大量纤维组织增生形成纤维间隔，分割正常的小叶结构，有假小叶形成(图1)。

Fig. 1Pathological changes of liver tissues (HE ×100)

4N，6N，8N：Normal control at the 4th，6th，8thweek； 4M，6M，8M：Liver cirrhosis at the 4th，6th，8thweek

2.3肝组织中TGF-α蛋白的表达

正常肝组织几乎未见阳性染色。肝硬化模型组可见肝细胞、肝窦血管内皮细胞、肝窦旁的间质细胞有表达，阳性染色细胞数在模型4周组最多，6周组明显减少，8周组与正常对照组相同(图2)。对染色结果做半定量分析：与相应的正常对照组相比，阳性染色细胞占视野总细胞的百分数在肝硬化模型4周组显著增加，在模型6周和8周组变化不显著(表2)。

Fig. 2Expression of TGF-α protein in liver tissues detected(Immunohistochemistry ×400)

4N，6N，8N：Normal control at the 4th，6th，8thweek； 4M，6M，8M：Liver cirrhosis at the 4th，6th，8thweek

2.4肝组织中TGF-β1蛋白的表达

正常肝组织几乎未见阳性染色。肝硬化模型组可见变性肝细胞周围的肝窦血管内皮细胞，肝窦旁的间质细胞，纤维间隔内的间质细胞，增生的胆管上皮细胞有阳性染色，阳性染色量随肝硬化病程进展逐渐明显增加(图3)。对染色结果做半定量分析：与相应的正常对照组相比，阳性染色细胞占视野总细胞的百分数在模型4周、6周和8周组逐渐显著增加(P<0.05，表2)。

Fig. 3Expression of TGF-β1 protein in liver tissues detected(Immunohistochemistry ×400)

4N，6N，8N：Normal control at the 4th，6th，8thweek； 4M，6M，8M：Liver cirrhosis at the 4th，6th，8thweek

GroupTGF-α(%)TGF-β1(%) Control4thweek6thweek8thweekModel4thweek6thweek8thweek1.2±0.51.3±0.31.4±0.68.7±0.9*4.1±0.82.3±0.60.5±0.20.6±0.20.5±0.36.3±1.2*11.6±2.1*#15.11±2.3*#△

TGF-α：Tumor necrosis factor-α; TGF-β1: Transforming growth factor-β1

*P<0.05vscontrol at the same time；?#P<0.05vsmodel 4thweek；?△P<0.05vsmodel 6thweek

2.5相关性分析

大鼠血浆中内毒素水平分别与血浆中TNF-α水平和Hcy水平呈正相关(P<0.01)；肝组织中TGF-α的表达与肝组织中TGF-β1的表达呈负相关(P<0.01)。

3　讨论

肝再生过程是一个复杂的被精确调控的过程，在这一过程中，TGF-α和TGF-β1相互协调，参与肝再生的启动和终止。如果它们之间的平衡被破坏，作为肝细胞增殖分化过程中的有丝分裂原TGF-α过度减少，而作为肝纤维化形成过程中最强有力的细胞因子TGF-β1过度增加，就会导致肝细胞再生延迟或速度减慢，纤维组织过度增生，最终发生肝纤维化乃至肝硬化[5，6]。

复合致病因素利用CCl4慢性中毒，低胆碱、高胆固醇、高脂肪、高醇饮食等因素导致肝脏发生炎症-纤维化-硬化，与人类多种慢性肝病最终发展为肝硬化的各个阶段相吻合，更接近临床[4]。TGF-α是肝细胞增殖分化过程中必不可少的有丝分裂原，能够促进肝细胞的分化、生长、再生[7]。TGF-β1是目前认为作用最强的促肝纤维化形成的关键细胞因子[8]。本项研究显示：与正常对照组相比，肝组织中TGF-α的表达只有在肝硬化模型4周组显著增加，而TGF-β1的表达在模型4周、6周和8周组持续显著增加，而且肝组织中TGF-α与TGF-β1的表达呈负相关。提示可能由于TGF-β1生成增加，纤维组织过度增生，导致肝细胞局部微环境发生改变，通过某种机制使TGF-α生成减少，肝细胞再生过程受抑制。Nakamura等研究显示，在二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)诱导肝损伤大鼠模型采用抗TGF-β分子干预治疗后，发现肝细胞再生水平提高肝细胞凋亡减少，同时肝脏内TGF-α等生长因子的转录水平上调[9]。

本项研究中肝硬化大鼠血浆中内毒素、TNF-α和Hcy水平随病程进展逐渐显著升高，血浆内毒素水平分别与血浆TNF-α和Hcy水平呈正相关。提示内毒素血症可能通过释放TNF-α以及高同型半胱氨酸血症，进一步加重肝损伤。另有研究报道内毒素可加强TGF-β1抑制肝再生，诱导肝细胞凋亡和促进窦周纤维化的作用[10]。TNF-α既可以增加肝细胞对TGF-α的敏感性，使肝细胞迅速进入增殖周期，还可以激活肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)产生TGF-β1[11]，TNF-α作为多效性的细胞因子，在肝细胞再生和纤维组织增生中的作用更为复杂。Hcy可引起短暂性的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成，通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶以及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路，促进TGF-β1等促纤维化的细胞因子表达[12]；Hcy还可通过内质网应激途径上调TRB3的表达，引起肝细胞周期G1期停滞，从而抑制肝细胞增殖[13]。因此，在肝受损区域，由诸多因素构成的微环境中，内毒素血症及其相伴产生的TNF-α水平增高，以及高同型半胱氨酸血症可能通过影响TGF-α和TGF-β1之间的平衡，调控肝细胞再生和细胞外基质成分的增生，参与肝纤维化、肝硬化的发生和发展。

综上所述，在肝硬化形成过程中，TGF-α的表达先增加后被抑制，TGF-β1的表达持续增加，导致肝细胞再生先增强后被抑制，纤维化程度不断加重，最终发生肝硬化。大鼠肝脏TGF-α和TGF-β1的这一特征性动态变化可能与内毒素血症及其相伴产生的TNF-α水平增高，以及高同型半胱氨酸血症有关，因此降低血浆内毒素水平和维持Hcy在正常范围内，对于调控肝细胞再生和细胞外基质增生的平衡具有重要意义。

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Dynamic changes of TGF-α and TGF-β1 in rats with liver cirrhosis induced by multiple pathogenic factors

TIAN Xiao-xia1, ZHANG Hui-ying1△, WANG Li-min2, LI Xu-jiong3, LIU Yan3, ZHANG Li-li1, BI Yang-hui

(1. Department of Pathophysiolog, 2. Funcitional Integrative Laboratory,3. Department of Physiology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

Objective: To explore the dynamic changes of transforming growth factor-α (TGF-α) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) of liver cirrhosis induced by multiple pathogenic factors in rats. Methods: Animals in the cirrhosis group were fed a mixture of maize flour, lard, cholesterol and alcohol plus subcutaneously injection with carbon tetrachloride (CCl4), the CCl4(0.5ml /100g·w) was injected at the first day of experiment and the 40% CCl4oil solution (0.3 ml /100 g·w) was injected at an interval of three days. The thirty-six male SD rats were randomly divided into liver cirrhosis group of the 4th, 6thand 8thweek, and normal control group of the 4th, 6thand 8thweek. The contents of alanine transferase (ALT), endotoxin, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and homocysteine (Hcy) in plasma were evaluated. Histopathological changes of the liver were observed under microscope with the staining of HE.The expressions of TGF-α and TGF-β1 were analyzed by the method of immunohistochemistry. Results: Compared with the corresponding normal control group, the levels of ALT, endotoxin, TNF-α and Hcy in plasma were gradually significantly increased in liver cirrhosis group of the 4th, 6thand 8thweek (P<0.05); the expression of TGF-α in the liver tissues was significantly increased at the 4thweek (P<0.05); the expression of TGF-β1 in the liver tissues was gradually significantly increased in every model group (P<0.05). Conclusion: In the formation process of cirrhosis, the expression of TGF-α was increased in liver of cirrhosis group at the 4th week, and later it was suppressed; the expression of TGF-β1 was continuously increased.The characteristic dynamic changes of TGF-α and TGF-β1 might be related to sustained endotoxemia, the high level of TNF-α and hyperhomocysteinemia.

liver cirrhosis；liver regeneration；liver fibrosis；TGF-α；TGF-β1;rats

国家自然科学基金资助项目(81070339)；山西省国际科技合作计划资助项目(2010081068)；山西省回国留学人员科研基金资助项目(211-091)；山西省高等学校大学生创新创业训练项目(2014308)

2015-04-28

2015-10-19

△Tel：13633555266； E-mail：zhanghy2001@163.com

R363

A

1000-6834(2016)01-065-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.017