石墨烯量子点对大鼠造血系统的影响*

王婷健， 王莎莉

(重庆医科大学生理教研室, 重庆 400016)



石墨烯量子点对大鼠造血系统的影响*

王婷健， 王莎莉△

(重庆医科大学生理教研室, 重庆 400016)

目的：研究石墨烯量子点(GQDs)对大鼠造血系统的影响。方法：30只SD雄性大鼠随机分为3组(n=10)：对照组、高、低剂量GQDs实验组(10 mg/kg·d，5 mg/kg·d)，对照组尾静脉注射等容积生理盐水，实验组尾静脉注射GQDs，连续28 d。麻醉处死,心脏取血，检测血常规及肝肾功能，获取骨髓单个核细胞(BMCs),流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。另取3只健康雄性SD大鼠体外培养大鼠四肢骨髓单个核细胞，GQDs分别作用24 h，48 h，72 h后，CCK-8检测细胞增殖情况，ELISA检测细胞上清液中粒-巨细胞刺激集落因子(GM-CSF)含量。结果：GQDs 在10 mg/kg·d剂量范围内，实验组大鼠红细胞数和血红蛋白浓度显著增高(P<0.05)；白细胞和淋巴细胞有增高的趋势；骨髓单个核细胞周期DNA合成前期(G1期)缩短(P<0.01)，DNA合成期(S期)显著延长(P<0.01)，细胞凋亡无明显影响; 甘油三酯和高密度蛋白浓度显著降低(P<0.01)。GQDs作用72 h大鼠骨髓单个核细胞明显增殖(P<0.05),细胞上清液中GM-CSF含量显著增加(P<0.01)。结论：一定浓度的GQDs可促进大鼠造血功能。

石墨烯量子点；造血系统；骨髓单个核细胞；大鼠

石墨烯量子点(graphene quantum dots,GQDs)是由碳原子组成的石墨烯家族的最新成员,作为一种新型碳材料量子点,其量子限制效应和边效应可诱导自身发出荧光；利用含氧活性基团化学反应性不同, 可以与多种有特定化学和生物性能的化学基团和功能分子进行共价反应,对石墨烯进行表面功能化修饰，达到超高的载药量、靶向输送和药物的可控释放的目的。由于其稳定化学性质,特殊荧光特性,良好生物安全性[1，2]和水溶液稳定性,越来越受到人们的重视。在生物医药领域作为药物载体[3,4]、细胞组织成像[5,6]、DNA嵌入剂[7]、荧光探针[8]等已得到广泛应用, 但其对机体造血功能的影响还未见到相关报道。本研究将通过体内外实验研究GQDs对大鼠造血系统的影响,为其应用于改善及保护造血系统提供实验参考依据.

1　材料与方法

1.1实验试剂与仪器

试剂:CCK-8试剂盒(Dojindo)，ELISA检测试剂盒(ABCAM公司)，石墨烯量子点(购自南京先丰纳米有限公司)，白蛋白测定试剂盒、球蛋白测定试剂盒，肌酐测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒，高密度脂蛋白测定试剂盒,均购自北京利德曼生化股份有限公司。

仪器:流式细胞仪(Beckman，美国)；酶标仪(普天-PT，国产)；紫外/可见分光光度计 (Lambda25, 美国) ；日本光电血细胞分析仪及配套试剂(MEK-6318K，日本)；全自动生化分析仪(CS-T300，国产)

1.2实验分组

健康雄性SD大鼠30只 (重庆医科大学实验动物中心提供),体重180～200 g,随机均分成 3组(n=10)：对照组、高剂量实验组、低剂量实验组,分3笼饲养。适应7 d 后,每只实验大鼠称重，高剂量实验组给药剂量10 mg/kg·d,低剂量实验组给药剂量5 mg/kg·d，尾静脉注射GQDs水溶液，对照组注射等容积生理盐水,连续注射5 d，间隔2 d，注射28 d，28 d 后取材。

1.3检测指标

1.3.1一般情况每天在规定时间内记录饮食和体重，并观察饮食、排泄、皮毛、活动状况和反应等。

1.3.2血常规及肝肾功能上述大鼠处理28 d后，腹腔注射致死剂量麻醉剂水合氯醛，心脏取血，收集血液样品于凝血管中，医院送检。日本光电血细胞分析仪进行血常规检测，血常规检测指标:白细胞计数(white blood cell,WBC)、红细胞计数(red blood cell,RBC)、血红蛋白测定(hemoglobin，HB)、红细胞比积(hematocrit，HCT)、红细胞平均容量(mean corpuscular volume,MCV)、红细胞平均血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin,MCHC)、血小板计数(platelet count,PLT)、淋巴细胞(LY)。采用全自动生化分析仪检测肝肾功能指标肌酐(creatinine,Cr)、总蛋白(totalprotein,TP)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、球蛋白(globulin,G)、白蛋白(albumin,A)、甘油三酯(triglycerides,TG)。

1.3.3GQDs对骨髓单个核细胞的细胞周期与凋亡的影响实验大鼠心脏取血后，无菌条件下迅速取其股骨，在超净台中将全部骨髓冲入4℃ 5 ml灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，反复吹打获得骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMCs)悬液,随后以4℃ 1 000×g 离心5 min,细胞团用5 ml磷酸缓冲液重新悬浮，将骨髓细胞悬液缓慢置于2ml的淋巴细胞分离液(密度1.077 g/ml)之上,在4℃、2 000×g 离心20 min,离心后细胞分为3层,收取位于分离递质之间的单个核细胞,PBS重悬,再低温离心2次×5 min，以洗除残余淋巴细胞分离液，用无菌PBS 制成细胞悬液并计数, 1 000×g 离心5 min, 500 μl灭菌磷酸盐缓冲液复悬,流式细胞仪检测细胞周期; 1 000×g 离心 5 min，-20℃，70%乙醇溶液中固定，4℃保存过夜,流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4体外实验观察GQDs对造血系统的影响

1.4.1CCK-8检测骨髓单个核细胞增殖另取健康雄性SD大鼠3只 (重庆医科大学实验动物中心提供),体重 180～200 g,颈椎脱臼处死,无菌条件下迅速取其股骨，在超净台中将3只大鼠全部骨髓混合冲入4℃ 5 ml灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)中,反复吹打获得骨髓单个核细胞悬液，随后以4℃、1 000×g离心5 min,细胞团用5 ml磷酸缓冲液重新悬浮,将骨髓细胞悬液缓慢置于2 ml的淋巴细胞分离液(密度1.077 g/ml)之上,在4℃、2 000×g离心20 min,离心后细胞分为3层,收取位于分离递质之间的单个核细胞,PBS溶液重悬,再低温离心2次×5 min,以洗除残余淋巴细胞分离液,用灭菌PBS 制成细胞悬液并计数,按1×104cells/ml的细胞数转入96孔细胞培养板中,设置正常对照组、高浓度实验组(500 μg/ml)、低浓度实验组(250 μg/ml),每组5个复空置37℃、5%CO2、95%饱和湿度的CO2培养箱内分别培养24 h,48 h,72 h,各个时间点每孔加入10 μl CCK-8试剂,培养箱内放置4 h,酶标仪检测OD值。

1.4.2ELISA检测骨髓单个核细胞上清液GM-CSF含量另取健康雄性SD大鼠1只 (重庆医科大学实验动物中心提供),体重 180～200 g,颈椎脱臼处死,无菌条件下迅速取其股骨，在超净台中将大鼠全部骨髓冲入4℃ 5 ml灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)中,反复吹打获得骨髓单个核细胞悬液，随后以4℃、1 000×g离心5 min,细胞团用5 ml磷酸缓冲液重新悬浮,将骨髓细胞悬液缓慢置于2 ml的淋巴细胞分离液(密度1.077 g/ml)之上,在4℃、2 000×g离心20 min,离心后细胞分为3层,收取位于分离递质之间的单个核细胞,PBS溶液重悬,再低温离心2次×5 min,以洗除残余淋巴细胞分离液,用无PBS 制成细胞悬液并计数,按1×106cells/ml的细胞数转入细胞培养板中,设置正常对照组，GQDs高浓度(500 μg/ml)实验组，GQDs低浓度(250 μg/ml)实验组,分别培养48 h，72 h后，细胞液2 000×g离心20 min,收集细胞上清液, 利用 ELISA 法测定细胞上清液中粒-巨细胞刺激集落因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF)含量.操作步骤均严格按照相应试剂盒使用说明进行。

1.5统计学处理

2　结果

2.1一般情况观察

高、低剂量实验组动物与生理盐水对照组实验大鼠均皮毛光滑,反应灵敏,饮食，活动正常，体重呈增长趋势。GQDs实验组和生理盐水尾静脉注射期间，各组大鼠体重呈持续上升的趋势，组间体重差异无统计学意义(表1)。

2.2GQDs对大鼠血常规

高、低剂量的GQDs实验组血常规检测中红细胞数,血红蛋白浓度有明显增高,与生理盐水对照组相比有统计学意义(P<0.05,P<0.01,表2)。白细胞，淋巴细胞有增高的趋势，但无统计学意义。

2.3GQDs对肝肾功能的影响

高、低剂量的GQDs组甘油三酯及高密度蛋白浓度与生理盐水对照组相比均有明显降低(P<0.05,P<0.01,表3)。

2.4GQDs对大鼠骨髓单个核细胞细胞周期及凋亡的影响

实验组大鼠骨髓单个核细胞与对照组细胞凋亡相比无显著差异,GQDs对大鼠骨髓单个核细胞凋亡几乎无影响(表4，图1，见彩图页Ⅲ)。与对照组相比，高剂量组细胞周期DNA合成前期明显缩短, DNA合成期明显变长(P<0.05,P<0.01，表4, 图2，见彩图页Ⅲ)。

Tab. 1　Comparison of rats body weight after twenty eight days (g， ±s， n=10)

LD：Low dosage; HD: High dosage

Tab.

WBC: White blood cell； LY: Lymphocyte; RBC: Red blood cell； HG: Hemoglobin； MCHC: Mean corpuscular hemoglobin； MCV: Mean corpuscular volume; HCT: Hematocrit； PLT: Platelet; LD：Low dosage; HD: High dosage

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group; GODs: Graphen quantum dots

Tab. 3　Effectof GQDs on liver and kidney function on ±s， n=10)

CRE: Creatinine; TG: Triglyceride; CHO: Total cholesterol; HDL: Highdensity lipoprotein; G: Globulin; A: Albumin; TP: Total protein; LD: Low dosage; HD: High dosage

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab.

AR: Apoptosis ratio; LD: Low dosage; HD: High dosage; GQDs: Graphene quantum dots; BMCs: Bone marrow mononuclear cells

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.5GQDs对大鼠骨髓单个核细胞体外增殖的影响

GQDs作用48 h,72 h后实验组细胞与对照组相比OD值明显上升(P<0.05，表5)。72 h后高浓度实验组细胞增殖率高达80%以上。

2.6GQDs作用大鼠骨髓单个核细胞上清液中GM-CSF的含量变化

GQDs作用48 h, 72 h后高、低浓度实验组GM-CSF含量均显著高于对照组(P<0.01,表6)。

Group24h48h72hControl0.32±0.020.31±0.020.36±0.03LC0.37±0.03*0.39±0.01*0.61±0.04*HC0.38±0.03*0.43±0.02*0.70±0.06*

LC: Low concentration; HC: High concentration; GQDs: Graphene quantum dots； BMCs: Bone marrow mononuclear cells

*P<0.05vscontrol group

Group48h72h Control442.49±5.03469.76±12.11LC1166.15±6.65**1815.80±10.06**HC3196.89±15.74**3994.58±26.83**

LC: Low concentration; HC: High concentration; GQDs: Graphene quantum dots; GM-CSF: Granulocyte macrophage colony stimulating factor； BMCs: Bone marrow mononuclear cells

**P<0.01vscontrol group

3　讨论

造血系统维持造血细胞的生成、调控、破坏,是维持机体生命活动的基本保障。造血系统损伤导致的血液疾病成为危害人类健康的重要杀手之一。保护并改善人体造血系统,不仅有助于治疗各种血液疾病,还能辅助抗肿瘤。目前对恶性肿瘤的治疗常采用化疗和放疗，但其在杀伤肿瘤细胞的同时常引起骨髓抑制，出现白细胞、红细胞和血小板减少等副反应,使得肿瘤治疗达不到理想的治疗效果。血细胞发生是造血干细胞经增殖、分化直至成为各种成熟血细胞的过程。在这个过程中，造血细胞增殖活跃的特点是许多药物以及生物材料使用过程中容易造成骨髓抑制的原因之一，从而限制了它们在临床上的应用。CdTe量子点等[9]纳米材料对造血系统的影响表明，不同纳米材料对造血系统影响不同。石墨烯量子点作为一种新型生物纳米材料,已展现出了广泛的应用前景，其对造血系统影响的研究以及应用还比较缺乏。

我们首先给实验大鼠尾静脉注射5 mg 和10 mg/kg·d GQDs溶剂 28 d，观察GQDs对大鼠造血系统的影响。血常规检测证实GQDs能明显增高外周血中红细胞数量和血红蛋白浓度，对白细胞和淋巴细胞有增高的趋势，流式细胞检测发现对骨髓单个核细胞的凋亡没有明显影响，同时10 mg/kg·d GQDs可以使大鼠骨髓单个核细胞G1期显著降低，S期百分比明显增高。S期是DNA合成期，是细胞周期的关键时期，期间DNA含量将增加一倍，并合成一定数量的组蛋白，供DNA形成染色体初级结构，因此S期细胞百分比的增加提示：GQDs能促进骨髓单个核细胞的细胞周期活跃，造血功能增强，这与外周血中血常规检测结果基本一致,并且对肝肾功能不产生影响。

骨髓单个核细胞属于造血干细胞进一步分化增生的一系，其中含有少量的造血干、造血祖细胞以及红系、粒系、单核系、巨核系、淋巴系。骨髓单个核细胞不仅是造血系统中重要的组成成员[10],还可分泌多种造血生长因子, 具有重要的造血活性[11]。在骨髓单个核细胞分泌众多的造血生长因子中，GM-CSF是最重要的一种。GM-CSF为造血的正调控因子[12]，作用的主要靶细胞是骨髓不同发育阶段的造血细胞，能在造血干、祖细胞水平上有效地刺激粒细胞-巨噬细胞系增殖分化和成熟，还能与EPO协同促进爆式红系集落形成单位(BFU-E)形成，使G0期的造血祖细胞进入S期，并缩短造血祖细胞的增殖时间。GM-CSF与白介素-3构成的融合蛋白能促进骨髓细胞的增殖[13]。GQDs可明显促进骨髓单个核细胞的增殖,同时具有时间和剂量依赖性。因此我们推测，GQD是通过促进骨髓单个核细胞分泌GM-CSF，进而作用于不同阶段的造血细胞，促进细胞周期活跃，特别使G0期细胞进入S期，最终上调造血功能，增加外周血红细胞数量。但其对造血系统作用详细机制研究有待进一步深入。

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The effects of graphene quantum dots on hematopoietic system in rats

WANG Ting-jian, WANG Sha-li△

(Department of Physiology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Objective: To study the effects of graphene quantum dots(GQDs)on hematopoietic system in rats. Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into three groups (n=10):control group, high dose group(10 mg/kg·d), low dose group(5 mg/kg·d), The rats in experimental group were intravenous injected with GQDs for 28 days and those in control group were injected with normal saline at the same volume. Routine blood and the function of liver and kidney were detected by instrument analysis. The cycle and apoptosis of bone marrow mononuclear cells(BMCs) were detected by FCM. The other three only healthy male SD rat bone marrow mononuclear cells(BMCs) were cultured by joining GQDs for 24 h,48 h,72 h in vitro, the proliferation was assayed by CCK-8, the content of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) from cultural supernatants were detected by ELISA. Results: The amount of red blood cell and concentration of hemoglobin from experimental group were increased significantly compared with those of control groups(P<0.05), the concentration of triglyceride and high density lipoprotein were decreased. DNA synthesis period was prolonged(P<0.01), there was no significant difference in apoptosis. BMCs were promoted proliferation clearly after using GQDs for 72 h(P<0.05). The content of GM-CSF was increased(P<0.01). Conclusion: GQDs may promote hematopoietic function in rats.

graphene quantum dots;hematopoietic system;bone marrow mononuclear cells;rats

2015-06-08

2015-10-26

△Tel：023-68892728; E-mail: 63557408@qq.com

Q599

A

1000-6834(2016)01-060-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.016