体外血脑屏障的建立

李联平，蒋莹

(1 海军总医院，北京100048；2 北京市肛肠医院)



·基础研究·

体外血脑屏障的建立

李联平1，蒋莹2

(1 海军总医院，北京100048；2 北京市肛肠医院)

目的利用大鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞于体外建立血脑屏障。方法分别取10只出生7～10 d、2只出生1～3 d的SD大鼠，断头处死后取脑组织，分别分离培养脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞，采用免疫细胞染色方法鉴定脑微血管内皮细胞，以脑微血管內皮细胞因子Ⅷ作为标记抗原，以神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)作为标记抗原鉴定星型胶质细胞。以非接触方式共培养脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞的方法建立体外血脑屏障。接种12 d将电极插入待测Transwell小室(培养模型)、细胞培养液、空白Transwell小室(细胞培养液为媒介)。测定跨膜电阻、测算荧光素钠渗透系数(Pe)，衡量模型完整性。结果接种12 d时，模型、细胞培养液、空白Transwell小室的电阻值分别为180、64、112 Ω/cm2。接种12 d时模型Pe为(4.67±0.4)×10-6cm/s。结论成功建立体外血脑屏障，屏障效应较好、完整性较高。

血脑屏障；细胞屏障；动物实验；大脑；脑微血管内皮细胞;星型胶质细胞

血脑屏障是血液与脑组织间的一种特殊屏障，由微血管内皮、基膜和星型胶质细胞等构成，其中内皮细胞是血脑屏障的主要结构。血脑屏障具有保证脑的内环境高度稳定、保护中枢神经系统的活动机能、阻止微生物和毒素等异物侵入脑组织的功能。以往在体血脑屏障动物实验存在动物脑组织内药物浓度较低无法准确测量、动物体内影响因素较多等缺点。血脑屏障模型的研究主要经历了脑血管碎段模型、脑微血管内皮细胞模型的构建、星型胶质细胞和血管内皮细胞共同模型的培养等3个阶段[1]。但目前尚无统一模型鉴定标准[2，3]。我们分离培养了乳鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞，成功构建大鼠体外血脑屏障模型，现将结果报告如下。

1　材料和方法

1.1实验动物、试剂及仪器出生1～3 d的SD大鼠(雌雄不等，体质量4～10 g)2只、出生7～10 d的SD大鼠(雌雄不等，体质量8 ～10 g)10只由军事医学科学院实验动物中心提供,DMEM、F12培养基、胎牛血清和血管内皮细胞专用培养基购自北京裕恒丰科技有限公司，青霉素、链霉素、两性霉素B购自北京拜尔迪生物技术有限公司，Hanks平衡液、0.25%胰酶EDTA和胶原酶Ⅱ购自北京翰天生物技术有限公司，荧光素钠(FLU)和胎牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich化学试剂公司；Transwell-clear小室购自北京康宁公司，抗鼠血管内皮细胞Ⅷ因子抗体、抗鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)抗体、AB染色试剂盒和二步法化学免疫检测试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的体外分离培养取10只出生7～10 d的SD大鼠，断头处死后取脑组织，参照文献[4]分离和纯化脑微血管内皮细胞，以血管内皮细胞因子Ⅷ为标记抗原,采用免疫细胞染色方法鉴定(染色细胞呈棕红色视为阳性)细胞。将培养得到的原代脑微血管内皮细胞传代至第3代备用。取2只出生1～3 d的SD大鼠，断头处死后取脑组织参照方法[5]分离培养星型胶质细胞：剪碎脑皮质层组织，0.25%胰酶-EDTA吹打悬浮，37 ℃、CO2培养箱中消化10 min,200目筛网过滤，取滤过液2 000 r/min离心5 min。弃上清液，悬浮沉淀物，以细胞密度1×105/mL接种于25 cm2培养瓶中，隔日换液。以GFAP为标记抗原鉴定细胞。脑微血管內皮细胞及星型胶质细胞免疫细胞染色鉴定结果见图1。

1.3体外血脑屏障模型的建立采用脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养[6]方法建立体外血脑屏障。取适量脑微血管内皮细胞，以1.6×105/mL的细胞密度接种于Transwell小室膜上。另取适量星型胶质细胞，以2.5×105/mL的细胞密度接种于Transwell板底部。上室和下室各自加入1.5、2.5 mL专用培养基和普通培养基培养细胞。

注：A为脑微血管内皮细胞；B为星型胶质细胞

图1脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞体外分离鉴定结果

1.4模型完整性鉴定接种12 d取模型，采用细胞电阻仪测定跨膜电阻：校正电阻仪并且平衡电极后，将电极插入待测Transwell小室中，长电极在外部，短电极在内部。用相同方法可测定空白Transwell板(细胞培养液为媒介)和细胞培养液的电阻值。接种12d取模型，采用荧光素钠渗透性实验计算跨膜荧光素钠渗透系数(Pe)[7]：共培养Transwell板中的细胞融合生长电阻值保持恒定后，将Transwell小室转移到盛有基础培养基的六孔板中。37 ℃培养箱预热15 min，吸取1 μg/mL荧光素钠基础培养基1.5 mL置换上室培养液，下室用2.5 mL基础培养基置换，37 ℃培养箱中进行渗透实验。采用多功能酶标仪测定荧光素钠浓度，累积相加浓度即为相应时间点的渗透浓度值，计算Pe[7]。以跨膜电阻和Pe代表模型的完整性。细胞电阻值大小代表细胞生长的好坏，细胞电阻值太小说明细胞没有融合生长，细胞层存在漏隙。当Pe≥2×10-6cm/sec时说明细胞屏障效应好，模型无渗漏完整性好。

2　结果

接种12 d时模型、细胞培养液、空白Transwell小室的电阻值分别为180、264、112 Ω/cm2。接种12 d时模型Pe为(4.67±0.4)×10-6cm/s。

3　讨论

血脑屏障是血液和脑组织间的一种特殊屏障，由微血管內皮、基膜和星型胶质细胞等构成，其中内血管内皮细胞是构成血脑屏障的主要结构。对体外血脑屏障模型的研究，以往文献大多是使用细胞株来建立模型，且鉴定模型的功能性可靠性较差。本研究应用新生乳鼠，取材方便，并提取大鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞作为原代细胞，用非接触共培养方式培养细胞，更好的维护了细胞的生长环境，保持了血管内皮细胞的功能特征[8，9]。脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞共培养建立的血脑屏障模型，比单一细胞所建立的模型接近体内细胞的体内的生理状态[10]。本研究运用细胞电阻仪监测细胞生长情况，当细胞电阻达到峰值，无明显变化时，说明细胞生长已饱满。且细胞间连接紧密限制了分子物质旁细胞途径的扩散渗透，一定程度上达到了体内细胞间的紧密性。

脑微血管内皮细胞能表达多种转运蛋白和药物代谢性酶，如P-糖蛋白，细胞色素P-450酶等[8]。其中，P-糖蛋白是一种ATP结合盒转运蛋白之一，显著表达在脑微血管内皮细胞腔膜上[12]。它主要以行使细胞排出外来物质的功能职责[12]。P-糖蛋白拥有相当广泛的底物物质，包括许多不同类的临床应用药物：离子钙通道拮抗剂、各种抑制素、阿片样物质，HIV蛋白酶抑制剂、免疫抑制剂、肾上腺素拮抗剂、抗菌药物等[13]。同时，依靠某一药物抑制内皮细胞中P-糖蛋白，能促进另一药物通过血脑屏障系统[14]。脑微血管内皮细胞的分离培养注意事项参照文献[4]。大鼠星型胶质细胞分离培养相对简单，但需注意几个问题：①胰酶-EDTA的消化时间和所需消化液浓度。消化时间太短，胶质细胞不能够完全消化下来，细胞量太少，接种生长就困难。消化时间太长则细胞失去活性不易生长。本研究实验以消化3～5 min为宜。有文献报道[15]消化液浓度应为0.125%胰酶-EDTA，本研究经过实验研究认为使用0.25%胰酶-EDTA效果好，细胞量多易于生长接种。②细胞接种密度。由于胶质细胞生长较快，接种密度宜控制在1×104～1×105/mL之间，密度太大细胞生长受限密度太小生长尤其慢。本研究荧光素钠所得渗透系数为(4.67±0.4)×106cm/s与以往的文献相比相似[16～17],说明所建立的血脑屏障模型达到了实验研究目的。

人体各种屏障系统是药物在体内浓度分布不均的重要因素。药物经过屏障系统时，药物相互作用是药物药效改变或药物毒副作用加强的重要原因，以前研究药物相互作用主要聚焦在药物生物利用度及药物全身性浓度的改变[18]。

综上所述，成功建立体外血脑屏障，屏障效应较好、完整性较高。

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国家自然科学基金资助项目(81273598)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.008

R741

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1002-266X(2016)27-0028-03

2016-02-29)