转染Elf5基因的人卵巢癌干细胞增殖、侵袭能力及凋亡变化

仇影影，谢肖磊，邱玲琳，闫洪超

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221002；2徐州医学院附属医院)



·基础研究·

转染Elf5基因的人卵巢癌干细胞增殖、侵袭能力及凋亡变化

仇影影1，谢肖磊1，邱玲琳1，闫洪超2

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221002；2徐州医学院附属医院)

目的观察转染Elf5基因的人卵巢癌干细胞增殖、侵袭能力及凋亡变化。方法将目的基因Elf5+EGFP克隆到载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-Elf5+EGFP，转入感受态细胞，挑选阳性克隆菌落，大量抽提质粒。培养人卵巢癌干细胞并分为重组质粒组、空质粒组、空白对照组。重组质粒组转染pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核表达载体，空质粒组转染pcDNA3.1-EGFP空载质粒，空白对照组不进行转染。采用Western blotting法检测Elf5蛋白。分别于转染后1、2、3、4、5、6 d采用MTT法检测细胞增殖能力；转染24 h后采用侵袭小室检测细胞侵袭能力并计算穿膜细胞数；转染24 h后流式细胞术检测不同周期细胞及凋亡细胞。结果成功构建了pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核细胞表达载体，重组质粒组细胞中Elf5蛋白稳定表达。转染后1、2、3、4、5、6 d重组质粒组细胞增殖能力低于空白对照组和空质粒组(P均<0.05)。重组质粒组穿膜细胞数少于空质粒组、空白对照组(P均<0.05)。重组质粒组G0/G1期细胞百分比高于空质粒组、空白对照组(P均<0.05)。重组质粒组细胞凋亡率高于空质粒组、空白对照组(P均<0.05)。结论转染ELF5基因的人卵巢癌干细胞增殖、侵袭能力受到抑制，细胞凋亡增多。

Elf5基因；卵巢癌；肿瘤干细胞；细胞增殖；细胞凋亡

在女性生殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌恶性程度最高，病死率居于首位[1]。卵巢癌之所以易转移和复发，根本原因在于肿瘤干细胞[2～4]。我们前期研究筛选出具有肿瘤干细胞特征的卵巢癌干细胞(以人HO8910细胞系为实验对象)，经鉴定发现筛选出的细胞具有较强的分化、自我更新能力，并有多药耐药性较高的干细胞相关基因表达水平和体内成瘤特性[5]。Elf5是Ets基因家族成员之一，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[6,7]。Elf5与卵巢癌干细胞的关系目前尚未见报道，为此，2015年1～10月，我们观察了转染Elf5基因的人卵巢癌干细胞增殖、侵袭能力及凋亡的变化，现报告如下。

1　材料与方法

1.1主要实验材料DNA内切酶、DNA连接酶及DNA marker购自Fermentas公司；DNA凝胶回收试剂盒及琼脂糖购自天根生化科技有限公司；中量抽提试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司；无乙水醇、异丙醇、丙三醇及无水氯化钙购自北京国药集团化学试剂有限公司；人卵巢癌干细胞由本课题组保存；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司； Liptapfector脂质体转染试剂购自碧云天生物技术有限公司；Elf5一抗及Transwell 小室购自美国Chemicon公司；大肠杆菌DH5α为本实验室保存。

1.2pcDNA3.1- Elf5+EGFP载体的构建及鉴定目的基因上下游引物分别加BamHⅠ、EcoRⅠ及保护碱基，由上海吉玛制药技术有限公司合成引物，将oligo溶解成50 μmol/L，进行两轮PCR反应，利用Agarose电泳并切胶回收Elf5+EGFP基因片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分别对Elf5+EGFP基因片段和载体pcDNA3.1进行酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收。用T4DNA ligase连接双酶切，得到Elf5+EGFP基因片段和线性化载体。氯化钙法制备感受态细胞，将连接产物转化感受态细胞，从平板上鉴定并挑选阳性克隆菌落，置于含LB培养基的试管中培养。抽提菌液质粒进行双酶切鉴定并测序。测序结果与目的基因序列比对无误后，将菌液接种于LB培养基，进行质粒抽提，获得足够的重组质粒。

1.3细胞分组与Elf5基因转染人卵巢癌干细胞用含EGF、bFGF、Noggi、LIF的培养基培养，分为重组质粒组、空质粒组、空白对照组。重组质粒组转染pcDNA3.1- Elf5+EGFP真核表达载体，空质粒组转染pcDNA3.1-EGFP空载质粒，空白对照组不进行转染。转染结束后，用G418培养基对已转染细胞进行筛选并传代培养。Western blotting法检测Elf5蛋白。

1.4细胞增殖能力观察将三组细胞按1.5×104/孔分别接种于96孔培养板，分别于转染后1、2、3、4、5、6 d后加入MTT工作液，继续培养，最后加入二甲基亚砜终止反应。将96孔培养板置于BOIBASE2000全自动酶标仪上，在490 nm波长处测定吸光度值(A值)，代表细胞增殖能力。

1.5细胞侵袭能力观察转染24 h后采用侵袭小室检测卵巢癌干细胞的体外侵袭能力。分离并提取各组细胞悬液，以105/孔将细胞接种于侵袭膜上并培养。培养12 h后去除膜上基质胶及残留细胞，固定并进行染色，倒置显微镜下观察并计算穿膜细胞数，反映细胞侵袭能力。

1.6不同周期细胞检测转染24 h后胰酶消化、洗涤并离心细胞，固定细胞，加100 μL PBS并吹打细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度，用流式细胞仪分析不同周期细胞分布情况。

1.7凋亡细胞检测转染24 h后胰酶消化、洗涤并离心细胞，固定细胞，加100 μL PBS并吹打细胞，制成单细胞悬液，按annexin V-PI细胞凋亡双染试剂盒说明书进行染色，采用流式细胞术测算细胞凋亡率。

2　结果

2.1pcDNA3.1- Elf5+EGFP载体构建及转染情况酶切结果显示，在1 518 bp位置出现明显条带，与预计扩增片段大小相符，对照组未扩增出条带；DNA序列分析结果显示，目的基因序列与GenBank中基因序列完全相同，目的基因插入方向正确，证实重组质粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP构建成功。重组质粒组转染质粒后，细胞中Elf5蛋白表达上调，而空质粒组及空白对照组未检测到Elf5蛋白表达。

2.2各组细胞增殖能力比较转染后1、2、3、4、5、6 d重组质粒组A值低于空白对照组和空质粒组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组转染后不同时间A值比较

注：与重组质粒组相比，*P<0.05。

2.3各组细胞侵袭能力比较重组质粒组、空质粒组、空白对照组穿膜细胞数分别为(92.1±2.7)、(149.6±4.6)、(147.4±5.3)个，重组质粒组与空质粒组、空白对照组相比，P均<0.05。

2.4各组不同周期细胞分布比较重组质粒组G0/G1期细胞百分比高于空质粒组、空白对照组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组不同周期细胞分布比较±s)

注：与重组质粒组相比，*P<0.05。

2.5各组细胞凋亡率比较重组质粒组、空质粒组、空白对照组细胞凋亡率分别为31.4%±1.9%、9.1%±2.2%、8.7%±1.5%，重组质粒组与空质粒组、空白对照组相比，P均<0.05。

3　讨论

目前研究[8,9]表明，卵巢癌发生侵袭、转移及复发与卵巢癌干细胞的无限增殖、自我更新和多向分化能力有密切关系。Ets家族成员在正常细胞的增殖、生长、凋亡过程中发挥重要作用[10]。Elf5属于其成员之一，位于人类染色体11q13～15，此区域与其他脆性位点一样，易出现杂合性缺失。Elf5的完整结构域包含参与蛋白间相互作用的结构域、与苏氨酸/半胱氨酸核心序列结合的基序及两个共性结构域[6]。Elf5基因在胎盘滋养细胞、上皮外分泌腺和人类乳腺等器官中均有表达，但表达程度各不相同[11～15]。正常情况下，Elf5不仅可调节腺泡细胞的产生，还可影响胚胎发育[16]。有学者[17]研究表明，Elf5基因的杂合性缺失可导致乳腺成体干细胞增加，促进乳腺癌发病。近年来国外众多学者[18～20]也认为Elf5是乳腺癌发生发展过程中的潜在抑癌基因，有望成为乳腺癌新的治疗靶点。关于Elf5基因对人卵巢癌干细胞生物学行为的影响，目前报道较少。

本研究首先成功构建了重组质粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP，并将其成功转染人卵巢癌干细胞，然后从多方面研究了Elf5在体外的一系列生物学作用。我们发现，重组质粒组细胞增殖能力低于空质粒组及空白对照组，表明Elf5基因对卵巢癌干细胞增殖具有明显抑制及延缓作用。重组质粒组G0/G1期细胞百分比高于空质粒组、空白对照组，提示Elf5基因可抑制G0/G1期进展到S期、G2/M期，进一步推测Elf5基因对卵巢癌干细胞的增殖抑制作用可能与干扰细胞周期有关。侵袭小室实验结果显示，重组质粒组的穿膜细胞数少于空质粒组及空白对照组，表明Elf5基因可限制卵巢癌干细胞的侵袭及运动能力。本研究结果还显示，重组质粒组细胞凋亡率高于其余两组，提示Elf5基因不仅能抑制卵巢癌干细胞增殖，还可促进其凋亡。但对于Elf5基因通过何种机制影响卵巢癌干细胞的生物学行为，目前尚处于初级研究阶段。在以后的研究中，我们还将进一步探索Elf5基因的具体作用机制。

[1] Vargas-Hernández VM,Moreno-Eutimio MA,Acosta-Altamirano G,et al.Management of recurrent epithelial ovarian cancer[J].Gland Surg,2014,3(3):198-202.

[2] Zhang S,Chan M,Balch C,et al.Identification and characterization of cancer stem-like cells from human ovarian carcinomas[J].Biomass Bioenergy,2003,25(6):623-636.

[3] Bapat SA.Human ovarian cancer stem cells[J].Reprod,2010,140(1):33-41.

[4] Djordjevic B,Stojanovic S,Conic I,et al.Current approach to epithelial ovarian cancer based on the concept of cancer stem cells[J].J BUON,2012,17(4):627-636.

[5] Yan HC,Fang LS,Xu J,et al.The identification of the biological characteristics of human ovarian cancer stem cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(22):3497-3503.

[6] Zhou J,Ng AY,Tymms MJ,et al.A novel transcription factor,ELF5,belongs to the ELF subfamily of ETS genes and maps to human chromosome 11p13-15,a region subject to LOH and rearrangement in human carcinoma cell lines[J].Oncogene,1998,17(21):2719-2732.

[7] Choi Y,Sinha S.Determination of the consensus DNA-binding sequence and a transcriptional activation domain for ESE-2[J].Biochem J,2006,398(3):497-507.

[8] Hu L,McArthur C,Jaffe RB.Ovarian cancer stem-like side-population cells are tumourigenic and chemoresistant[J].Br J Cancer,2010,102(8):1276-1283.

[9] Shah MM,Landen CN.Ovarian cancer stem cells: are they real and why are they important[J].Gynecol Oncol,2014,132(2):483-489.

[10] Lee HJ,Ormandy CJ.Elf5,hormones and cell fate[J].Trends Endocrinol Metab,2012,23(6):292-298.

[11] Lapinskas EJ,Palmer J,Ricardo S,et al.A major site of expression of the ets transcription factor Elf5 is epithelia of exocrine glands[J].Histochem Cell Biol,2004,122(6):521-526.

[12] Myriam H,Ramya U,Paul T,et al.ELF5-enforced transcriptional networks define an epigenetically regulated trophoblast stem cell compartment in the human placenta[J].Hum Mol Genet,2010,19(12):2456-2467.

[13] Lee HJ,David GO,Anita L,et al.Progesterone drives mammary secretory differentiation via RankL-mediated induction of Elf5 in luminal progenitor cells[J].Development,2013,140(7):1397-1401.

[14] Lapinskas EJ,Svobodova S,Davis ID,et al.The Ets Transcription Factor ELF5 Functions as a Tumor Suppressor in the Kidney[J].Twin Res Hum Genet,2011,14(4):316-322.

[15] Pearton DJ,Smith CS,Redgate E,et al.Elf5 counteracts precocious trophoblast differentiation by maintaining Sox2 and 3 and inhibiting Hand1 expression[J].Dev Biol,2014,392(2):344-357.

[16] Lee HJ,Hinshelwood RA,Bouras T,et al.Lineage specific methylation of the elf5 promoter in mammary epithelial cells[J].Stem Cells,2011,29(10):1611-1619.

[17] Rumela C,Wei Y,Rose-Anne R,et al.Elf5 regulates mammary gland stem/progenitor cell fate by influencing notch signaling[J].Stem Cells,2012,30(7):1496-1508.

[18] Rumela C,Julie H,Mario AB,et al.Elf5 inhibits the epithelial-mesenchymal transition in mammary gland development and breast cancer metastasis by transcriptionally repressing Snail2[J].Nat Cell Biol,2012,14(11):1212-1222.

[19] Kalyuga M,Gallegoortega D,Lee HJ,et al.ELF5 suppresses estrogen sensitivity and underpins the acquisition of antiestrogen resistance in luminal breast cancer[J].PLoS Biol,2012,10(12):252-253.

[20] Frend HT,Watson CJ.Elf5 - breast cancer's little helper[J].Breast Cancer Res,2013,15(2):307-307.

闫洪超(E-mail：1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.008

R737.31

A

1002-266X(2016)19-0025-03

2015-12-04)