酵母双杂交技术筛选宫颈癌HeLa细胞cDNA文库中FAM92A1-289关联蛋白

沈君豪，方娟，郭兴荣，桂卉，涂汉军，阮绪芝

(湖北医药学院基础医学院，湖北十堰442000)



·论著·

酵母双杂交技术筛选宫颈癌HeLa细胞cDNA文库中FAM92A1-289关联蛋白

沈君豪，方娟，郭兴荣，桂卉，涂汉军，阮绪芝

(湖北医药学院基础医学院，湖北十堰442000)

目的应用酵母双杂交技术从宫颈癌HeLa细胞cDNA文库中筛选FAM92A1-289关联蛋白。方法构建酵母双杂交pGBKT7-FAM92A1-289诱饵载体，转化至酵母AH109感受态细胞中。利用Clontech GAL4酵母双杂交系统筛选HeLa细胞cDNA文库中与FAM92A1-289相互作用的蛋白质，用营养缺陷型培养基和X-a-Gal双重筛选实验进行筛选，对筛选结果进行生物信息学分析，对克隆重复率较高的蛋白进行回转验证，将β-半乳糖苷酶活性阳性的克隆进行测序并分析。结果成功构建酵母双杂交pGBKT7-FAM92A1-289诱饵载体，可在酵母细胞中正常表达FAM92A1-289，且对酵母细胞无毒性，不存在自激活现象。筛选出在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基及含X-a-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上均能生长且β-半乳糖苷酶活性阳性的克隆9个。经生物信息学分析发现4种蛋白重复率较高，即增殖细胞核抗原(PCNA)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)、内质网高尔基体中间室标记物53(ERGIC-53)、重组人BCL2相关永生基因1(BAG1)，并均与FAM92A1-289存在相互作用。结论利用酵母双杂交技术在Hela细胞cDNA文库中成功筛选出与FAM92A1-289相互作用的蛋白，为进一步研究FAM92A1-289的功能提供了新线索。

FAM92A1-289；酵母双杂交技术；宫颈癌；HeLa细胞；增殖细胞核抗原；内质网高尔基体中间室标记物53；BCL2相关永生基因重组人BCL2相关永生基因1；半乳糖凝集素1

FAM92A1-289是Ruan等[1]于2007年发现并克隆的新基因，其编码蛋白含289个氨基酸，属于FAM92A1家族。研究[2～5]发现FAM92A1-289定位于细胞核，在胚胎发育各个阶段、成人各个组织中都有表达，其在肿瘤组织和胚胎组织等增殖旺盛的细胞中表达水平较高[1]。FAM92A1-289是细胞核中与细胞增殖有关的小分子蛋白质，如果能找到与FAM92A1-289相关联的蛋白，将为细胞周期调控机制的相关研究提供线索。2013年12月～2014年12月，本研究采用酵母双杂交技术从宫颈癌HeLa细胞cDNA文库中筛选FAM92A1-289关联蛋白，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1实验材料HeLa细胞、酵母菌株AH109、大肠杆菌宿主菌DH5a、克隆有FAM92A1-289基因CDS序列的质粒pCDNA3.1-FAM92A1-289、酵母表达载体pGBKT7及相关质粒为本实验室保存；酵母双杂交所用试剂与材料、RNA提取试剂盒、cDNA文库构建试剂盒均购自TaKaRa公司；小鼠C-myc单克隆抗体、HRP标记的羊抗小鼠多克隆抗体、预染蛋白Marker和DAB显色试剂盒购自北京天根科技公司。

1.2诱饵表达载体pGBKl7-FAM92A1-289的构建及验证根据GenBank中人FAM92A1-289基因序列设计引物，引入BamH Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，P1序列为5′-ACTGGATCCAATCCCCGTCCTTG-3′；P2序列为5′-AGACTGCAGCTGCTTGTTGATCCTT-3′。以本实验室保存的pCDNA3.1-FAM92A1-289质粒为模板，PCR扩增FAM92A1-289基因片段，BamHⅠ和PstⅠ双酶切PCR产物和酵母表达载体pGBKT7；经琼脂糖核酸凝胶电泳回收FAM92A1-289片段和双酶切载体pGBKT7，4 ℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α；经PCR及质粒酶切鉴定，获得正确插入FAM92A1-289片段的诱饵质粒。酵母AH109感受态细胞的制备和转化均参照Clontech公司酵母手册提供的方法进行。采用PEG/LiAC法将pGBKT7-FAM92A1-289转化到酵母AH109感受态细胞中，铺于SD/-Trp平板，30 ℃静置培养3～5 d，直至白色克隆长出。随机挑取5个菌落进行PCR反应，验证诱饵质粒是否成功转化到AH109细胞中；采用Western blotting法检测诱饵蛋白；参考文献[6]方法验证诱饵质粒的毒性和自激活作用。

1.3HeLa细胞cDNA文库的构建取生长良好的HeLa细胞，收集于1.5 mL离心管中，PBS洗3次。按说明书提取细胞总RNA。取7 μL进行电泳检测，剩余置于-70 ℃冰箱保存备用。按说明书操作合成cDNA，纯化回收长度大于400 bp的DNA片段，将回收后的DNA与线性化的pGADT7-Rec载体连接，以电转法转化大肠杆菌感受态DH5α细胞，稀释10倍后涂于100块LB+Amp平板，待菌落长出后刮下菌苔，悬浮于20%甘油保存液中，-80 ℃保存，此即为cDNA扩增文库。取10 μL扩增文库的菌液，进行10倍连续梯度稀释，每个稀释梯度均取100 μL涂布LB+Amp平板，37 ℃倒置培养过夜，计算每个稀释梯度平板上生长的菌落数量。按照公式(平板上克隆数×稀释倍数×103/涂布体积)计算cDNA文库滴度。随机挑取16个在平板上生长的单克隆，以pGADT7载体上的序列设计引物pGADT7-F和pGADT7-R，PCR反应检测插入片段大小，提取文库质粒备用。

1.4FAM92A1-289相互作用蛋白的筛选

1.4.1文库质粒的大规模转化取1 mL诱饵菌株感受态细胞依次加入cDNA文库质粒100 μg、SS DNA 200 μL，加入6 mL PEG/LiAc剧烈震荡后以30 ℃、200 r/min震荡培养30 min；加入700 μL的DMSO缓缓倒置混匀8次，42 ℃水浴热休克15 min，每隔5 min混匀1次；热休克结束后立即插入冰浴中冷却2 min，室温下12 000 r/min离心2 min后弃上清；加入10 mL 1×TE重悬沉淀细胞，取200 μL涂布在SD/-leu/-His/-Trp三缺平板上，30 ℃培养直至白色酵母长出。

1.4.2β-半乳糖苷酶活性检测与诱饵蛋白相互作用的蛋白将激活LacZ，用β-半乳糖苷酶催化X-α-gal产生蓝色产物，使酵母变蓝。以转化了pGBKT7-53和pGBKT7-lam的AH109分别作为阳性对照和阴性对照，将长出的单克隆划线接种于含X-α-gal的SD/-leu/-His/-Trp三缺平板上。选取变蓝克隆，重新划线接种至含有X-α-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺平板上培养，重复转接3次后，选取仍能变蓝的克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测[7]。

1.4.3酵母质粒的提取与转化将经鉴定为阳性的酵母单克隆大规模培养后提取酵母质粒。将提取的酵母质粒分别转化大肠杆菌DH5α，涂布于LB+Amp平板，37 ℃培养，待长出菌落后保存菌株并提取质粒进行测序。

1.4.4阳性克隆的回转验证将提取出的质粒分别与诱饵质粒pGBKT7-FAM92A1-289再次转化酵母宿主菌AH109，挑取单克隆划线接种于含有X-α-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺平板上，将经多次重复鉴定为阳性的文库质粒再次测序。

1.5质粒生物信息学分析将测序结果通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的BLAST进行同源性比较，并做生物信息学分析。

2　结果

2.1诱饵质粒构建情况PCR扩增出的FAM92A1-289片段长度为846 bp(图1A)；重组质粒pGBKT7-hFAM92A1双酶切后获得2条清晰条带，即目的基因和载体片段，大小与预期相符(图1B)；诱饵质粒pGBKT7-hFAM92A1转化酵母AH109细胞的菌落经PCR反应，获得长度900 bp的条带，表明重组诱饵质粒pGBKT7-hFAM92A1成功转化到酵母AH109细胞(图1C)。Western blotting结果显示诱饵质粒在酵母AH109细胞中成功表达。紫外分光光度计检测OD600值确认重组质粒对酵母细胞无毒性作用。将诱饵菌株与对照菌株同时分别涂于SD/-Trp、SD/-Trp-his、SD/-Trp-ade、SD/-Trp-leu平板，培养3 d发现SD/-Trp平板都有菌落长出，其余平板无菌落长出，说明重组质粒无自激活作用。

图1　FAM92A1-289片段、重组质粒及诱饵质粒验证结果

2.2HeLa细胞cDNA文库构建情况提取的HeLa细胞总RNA经琼脂糖凝胶电泳示总RNA 28S、18S清晰且完整(图2A)，纯化的mRNA清晰可见(图2B)。构建的HeLa细胞cDNA文库滴度为1.7×106CFU。从文库中随机挑选16个单克隆进行PCR鉴定，显示文库重组率高(图2C)。

2.3FAM92A1-289相互作用蛋白筛选结果文库质粒大规模转化诱饵菌株后，涂布含X-α-gal的SD/-leu/-His/-Trp 3缺培养基上，检测报告基因Lac Z的表达，经过3次重复筛选，选取一直呈蓝色的克隆106个，经β-半乳糖苷酶活性检测后得到9个疑似阳性克隆，经回转实验验证并通过生物信息学分析筛选出4种蛋白，分别为增殖细胞核抗原(PCNA)、内质网高尔基体中间室标记物53(ERGIC-53)、重组人BCL2相关永生基因1(BAG1)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)。

图2　HeLa细胞cDNA文库构建验证结果

3　讨论

人类基因组测序计划已经完成，逐渐阐明基因的功能，特别是胚胎发育和肿瘤发生相关新基因的发现及功能研究是当前功能基因组研究的重点。重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)是筛选重要新基因的有效方法。我们由血管内皮细胞免疫家兔所得的抗血清来筛选爪蟾卵母细胞的cDNA表达文库，从理论上讲，筛选到的阳性克隆分子应该是与血管生成和胚胎发育相关的重要功能基因。CV973659是上述SEREX技术筛选出的一个高度保守的基因克隆，生物信息学分析显示CV973659在多个物种中高度保守，因此我们选择CV973659及其人类同源基因FAM92A1[1]进行基因克隆和功能研究。

酵母双杂交系统用于研究活细胞内蛋白质相互作用，灵敏度高。为克服酵母双杂交系统存在的假阳性较高的缺点，选择多个营养缺陷标记能大大降低假阳性的产生。本研究应用酵母双杂交法对HeLa细胞cDNA文库进行筛选，获得了4种与FAM92A1-289相互作用的蛋白分子，生物信息学分析表明四者有共同特点，即在增殖细胞、肿瘤细胞中高表达，参与细胞增殖、凋亡等过程，多与肿瘤的发病有关。

PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白，在增殖细胞中广泛表达，参与DNA复制过程，其结构在进化中高度保守，在S期细胞中高表达[8～11]。PCNA能与检验点蛋白Rad9、Hus1形成环状复合物，将多种修复相关蛋白引导到DNA损伤部位，参与DNA的损伤修复；PCNA还可与细胞周期蛋白(Cyclin)、依赖细胞周期蛋白激酶(CDK)和CDK抑制蛋白(CKI)相互作用，形成不同复合体，调控细胞周期；PCNA通过与肿瘤抑制因子(ING1)结合从而诱导紫外损伤细胞凋亡[8～10]；PCNA作为内源性增殖细胞标志物，可应用于肿瘤病理诊断，指导临床用药[11]。ERGIC-53是广泛存在的循环蛋白，在细胞蛋白分泌转运中发挥重要作用，与分泌性糖蛋白形成、运输及肿瘤发生有关，为肿瘤耐药相关基因[12，13]。通过RNAi抑制耐药肿瘤细胞株中ERGIC-53表达，可使耐药表型逆转[12，13]。BAG1在正常组织中几乎不表达，但在乳腺癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌等肿瘤细胞中均有表达，可与BCL-2形成复合物而增强抗凋亡能力，在肿瘤的发病与侵袭过程中发挥十分重要的作用[14，15]。BAG1可经由分子伴侣Hsp70、Hsc70介导，与多种底物蛋白发生相互作用，从而发挥其抑制细胞凋亡、调节基因转录等功能[14～17]。大量研究表明，BAG1可促使肿瘤细胞产生耐药。Galectin-1是一种分布广泛、作用复杂的半乳糖结合蛋白，其在细胞外基质和细胞核内均有表达，并广泛表达于中枢和外周免疫组织细胞中，还可诱导T细胞凋亡。Galectin-1在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞中表达上调，其可通过与癌基因H-Ras相互作用，增强Ras介导的信号转导通路功能，促进细胞恶性转化[18，19]。

我们前期研究发现，FAM92A1-289的非洲爪蟾同源基因xVAP019在胚胎广泛表达且在增殖旺盛的外胚层细胞中高表达[20]，提示其在神经细胞增殖及凋亡中起重要作用。我们将进一步研究FAM92A1-289与各关联蛋白的作用方式，探索FAM92A1-289在细胞凋亡、细胞周期调控中的具体作用机制。

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Screening of interacting proteins of FAM92A1-289 in Hela cell cDNA library by using yeast two-hybrid technique

SHEN Junhao,FANG Juan,GUO Xingrong,GUI Hui,TU Hanjun,RUAN Xuzhi

(Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

ObjectiveTo screen the interacting proteins of FAM92A1-289 in Hela cell cDNA library by yeast two-hybrid technique.MethodsThe bait plasmid pGBKT7-FAM92A1-289 was constructed and then transformed into yeast competent cells AH109.Clontech GAL4 yeast two-hybrid assay was performed to screen the interacting proteins of FAM92A1-289 in the Hela cell cDNA library.SD nutrient medium and X-a-Gal were used for selecting and screening.Moreover,back-cross was performed to confirm the interaction of identified proteins,and bioinformatics was used to analyze the sequences of clones of positive β-galactosidase.ResultsThe bait plasmid pGBKT7-FAM92A1-289 was successfully constructed and expressed FAM92A1-289 in yeast cells,showing no toxicity and self-activation.Nine colonies were identified after β-galactosidase test and selection of SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp plates containing X-a-Gal.Bioinformatics analysis shows four proteins had high repetition-rate,such as proliferating cell nuclear antigen (PCNA),galectin-1,endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment marker 53(ERGIC-53) and recombinant human BCL2-associated athanogene 1(BAG1).Furthermore,back-cross proved there was interaction between the identified proteins.ConclusionThe proteins interacting with FAM92A1-289 are successfully identified by yeast two-hybrid technique,which can provide clues for further investigation of the function of FAM92A1-289.

FAM92A1-289; yeast two-hybrid technique; cervical carcinoma; HeLa cell; proliferating cell nuclear antigen; endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment marker 53; recombinant human BCL2-associated athanogene 1; galectin-1

湖北省自然科学基金资助项目(2012FFB02001)。

沈君豪(1984-)，男，硕士，主要研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail: sjhkl2015@163.com

简介：阮绪芝(1966-)，女，博士、教授，主要研究方向为肿瘤分子生物学。E-mail: ruanxuzhi@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.001

Q78

A

1002-266X(2016)19-0001-04

2015-11-18)