金樱子对疲劳大鼠免疫细胞共刺激信号通路及免疫平衡作用的研究*

2016-08-31苏利强曾志强邹业兵

光明中医 2016年16期

苏利强　曾志强　邹业兵

【实验研究】

苏利强1曾志强2邹业兵1

共刺激分子是认识和治疗免疫性疾病的有效靶点。中医理论证明金樱子可以补血易精，减轻或缓解疲劳，本研究运用中医、中药理论探讨金樱子在预防疲劳方面的作用，金樱子以调节机体功能为主而非对抗，这种调节效应具有双向性和整体性。本研究以疲劳大鼠为模型，金樱子作为干预手段，结果发现金樱子可以矫正过度运动导致的免疫失衡，通过提高INF-γ的表达，促进细胞免疫功能提高，这一过程可能与金樱子上调B7-1的表达有关。

疲劳；免疫失衡；金樱子；共刺激信号通路

共刺激分子是认识和治疗免疫性疾病的有效靶点。中医理论证明金樱子可以补血易精，减轻或缓解疲劳，本研究运用中医、中药理论探讨金樱子在预防疲劳方面的作用，由于金樱子所含成分决定了它作用于机体有多靶点效应，另外，金樱子以调节机体功能为主而非对抗，这种调节效应具有双向性和整体性。结合共刺激分子B7-1和 B7-2的特点，开展以共刺激分子为新靶点来调节运动疲劳后免疫机能的作用机理研究。

1　研究对象与方法

1.1实验对象与分组情况实验对象：健康SD雄性大鼠30只，清洁级，由江西中医药大学实验动物中心提供。随即将动物分成正常对照组(A组，10只)，运动组(B组，10只)，运动+金樱子干预组(C组，10只)。

1.2模型建立大鼠适应性饲养3天后，运动组大鼠先进行3天适应性游泳运动训练(15min/1次/天)。待大鼠适应新环境和游泳状态后通过游泳运动训练建立运动疲劳导致免疫失衡模型，运动负荷如下：B组和C组大鼠采用不负重持续游泳，第1～15天一次力竭，第16～20天二次力竭，C组在正常游泳的同时采用金樱子灌胃。大鼠力竭的标准见表1。当三个状态出现时即定为力竭。

表1　大鼠力竭标准

并游泳训练期间对大鼠体质量、运动能力及活动状态进行详细观察并记录。

给药方法：动物给药从第1天开始。C组用金樱子水提取液灌服；金樱子水提取液(含生药量2.5 g/m1)。每只大鼠按5 g/d金樱子提取液每天灌胃1次。B组每日用生理盐水灌服至实验结束。

1.3样本采集与处理每组按照运动方案游泳结束后分别在8h后取材，颈部脱臼处死，股动脉取血5ml，分离血清低温保存待测。

1.4指标测试外周血共刺激因子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)的表达状况；通过IL-4、IFN-γ表达来推断Th1/Th2平衡状况。

采用ELISA法测定血清IL-4、IFN-γ、B7-1、B7-2含量。测试过程中在酶标仪上读出OD值，所有读出的OD值减除零孔值后再行计算。以标准品的OD值使用CurveExpert1.3软件绘制出标准曲线，计算样品含量。

1.5统计分析讨论统计分析所得数据，探讨不同运动方式导致的疲劳后免疫机能的变化状况，分析金樱子干预对不同运动方式的疲劳后免疫机能下降和共刺激因子B7-1、B7-2的表达的关系，从而探讨金樱子对不同运动方式疲劳后免疫机能的作用可能是与共刺激因子B7-1、B7-2的表达有关。

1.6主要试剂与仪器试剂：大鼠IL-4酶联免疫分析试剂盒48T、大鼠IFN-γ酶联免疫分析试剂盒48T、大鼠B7-1酶联免疫分析试剂盒48T、大鼠B7-2酶联免疫分析试剂盒48T等。

仪器：离心机、酶标仪(480nm波长)、恒温培养箱、电子天平、大鼠游泳池等。

2　结果

B、C组血清IFN-γ水平显著低于A组，而C组显著高于B组；C组IL-4水平非常显著低于A、B组；B组IFN-γ/ IL-4显著低于A组，而C组非常显著地高于B组。C组B7-1显著高于B组。见表2。

表2　各组相应指标变化情况表

注：1)表示与A组比较P<0.05，2)表示与A比较P<0.01；3)表示与B组比较P<0.05，4)表示与B组比较P<0.01。

3　讨论

运动性疲劳是指在运动过程中发生的一种疲劳症候，与内伤虚劳的发生密切相关。下图为运动性疲劳发生发展与金樱子改善免疫，调节疲劳的关系图，可以作为用金樱子治疗疲劳的依据。另有研究证明金樱子果实可做利尿剂、镇咳剂，动物实验证明金樱子能提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力，既有提高细胞免疫活性，又可以提高体液免疫功能，并具有一定的抗炎作用。因此，金樱子是一种能改善机体免疫能力的免疫调节剂。

图1　金樱子改善运动性疲劳提高免疫关系图

3.1运动与Thl/Th2的失衡本研究显示，10天游泳运动训练可使血清IFN-γ含量显著低于空白组，血清IL-4含量显著低于空白对照组，但IFN-γ/IL-4则低于空白对照组，导致这一现象的原因推测是10天的游泳运动负荷对大鼠机体产生良好的适应，血清IFN-γ、IL-4含量低于空白对照组，此时的免疫机能处于积极的状态，说明10天游泳运动可以导致Th1/Th2细胞之间的稳态失去平衡，使细胞免疫机能(IFN-γ主要介导细胞免疫)显著下降，而体液免疫(IL-4主要介导体液免疫)相对亢进，这是Th1/Th2向Th2方向漂移的原因，提示过量运动导致淋巴细胞亚群之间稳态失衡，大负荷运动会导致Th1/Th2向Th2方向漂移，使体液免疫相对占主导地位，导致机体免疫机能受到抑制，这一结果与大负荷运动对免疫机能的影响研究结果一致。

3.2B7-1和B7-2与运动免疫在免疫细胞活化过程中，Th0(未致敏的天然T细胞)通过TCR(T细胞受体)识别MHC(组织相容性抗原)抗原肽获得抗原识别第一信号，这一过程是免疫细胞活化的第一步，当细胞MHC识别第一信号后，还需要有共刺激分子提供的协调刺激信号第二信号，T细胞才能被激活。在此过程中共刺激分子B7家族是最重要的第二信号，它们在维持免疫效力和抑制自身免疫之间的微妙平衡是至关重要的作用。其中最重要的共刺激分子是B7家族成员的B7—1(文献也成为：CD80)和B7—2(文献也成为：CD86)。

B7-1和B7-2是表达在抗原递呈细胞(APC)表面的共刺激配体，两者均可与T细胞共刺激受体CD28和细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)结合，激活和调节T细胞免疫。

B7-1可促进Th0分化趋向Thl，而B7-2可促进Th0分化趋向Th2。B7-1和B7-2是通过调节性T细胞上的CD28和CTLA-4相结合，对调节性T细胞发挥不同的调节作用，控制免疫反应或耐受。Thl细胞优势分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，辅助TC、TD细胞增殖、分化、成熟，介导细胞免疫；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10、IL-5、IL-6、IL-13和TGF-B，辅助B细胞增殖、分化、成熟，介导体液免疫。Thl/Th2是一对重要的调节细胞，通过各自的细胞因子互为调节和抑制。

可见共刺激分子在淋巴细胞活化的重要作用，免疫学研究证实，人体内的Th0细胞在抗原递呈细胞共刺激分子B7-1、B7-2的刺激下可分别向Th1、Th2转化。B7-1主要刺激Th0细胞向Th1分化，而B7-2主要协同刺激Th0细胞向Th2分化。由于运动后免疫机能下降和Thl/Th2发生偏移有关，因此可以认为B7-1和 B7-2的表达对运动后免疫机能的作用较大。

在正常情况下，这两类细胞因子处于动态平衡状态。Thl/Th2的优势变化直接影响机体的免疫状态，且与疾病的发生、发展和转归密切相关。目前，已有大量证据论证了B7-1和B7-2共刺激因子控制体液免疫和细胞免疫的重要性。

3.3金樱子与免疫平衡金樱子作为药用，历史久远，古今中外文献具有记载，其功效、成分见表3。

表3　金樱子功效

过量运动后机体疲劳会产生免疫机能下降，从中医角度论述脏腑功能下降或失调和津血不足，表现为T淋巴细胞亚群失衡，Thl/Th2发生偏移，细胞增殖能力下降，现代医学认为这些失衡受T细胞活化信号的调控，而T细胞的活化除了需要特异性刺激信号Ag-MHC复合物外，还需要共刺激分子(如B7-1等)的存在，若缺乏共刺激分子，T细胞将进入无反应状态。

本研究结果显示运动组B7-1较对照组呈现下降趋势，而经过运动+金樱子干预的C组的B7-1显著高于运动组，显示金樱子可以促进B7-1 表达，从而可以改善由于运动造成的B7-1 下降，这一趋势和INF-γ的表达趋势比较接近，因此推断金樱子可以上调B7-1的表达促进细胞免疫的发展。

4　结论

大负荷运动可以导致Thl/Th2向Th2方向漂移，通过金樱子干预可以提高INF-γ的表达，促进细胞免疫功能提高，这一过程可能与金樱子上调B7-1的表达有关。

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