天麻素对大鼠皮质神经元缺氧损伤的保护作用

袁红英，王中师，王永清



天麻素对大鼠皮质神经元缺氧损伤的保护作用

袁红英，王中师，王永清*

天麻素；中枢神经元；缺氧

天麻为兰科天麻属植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的干燥块茎，为常用名贵中药，具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络之功效［1］，主要有效单体为天麻素（gastrodin，Gas），化学名称为4-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，又叫天麻苷，因其具有镇静、镇痛、抗惊厥、降压、抗炎、抗氧化等作用，临床上主要用于治疗眩晕、头痛、缺血性脑损伤等。为探讨天麻素对神经系统的保护作用机制，实验考察了天麻素对培养的皮质神经元缺氧损伤的作用［2-5］。

1　材料与方法

1.1实验材料当天新生Wistar大鼠，CO2培养箱（Baxer，美国），解剖显微镜（CarlZeiss，德国），塑料培养皿和96孔板（Nunc，丹麦），酶标仪（山东高密仪器厂）；DMEM（高糖型，Sigma），HEPES（Sigma），EGTA（Sigma），马血清（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），Hank’s平衡盐溶液（Sigma），胰蛋白酶（新疆生化研究所），台盼蓝（华美生物工程公司），连二亚硫酸钠（Sigma），CCK-8试剂盒（上海博谷生物科技公司）等。

1.2实验方法

1.2．1大鼠皮质神经元的分散和培养取当天新生的Wistar大鼠，用75%乙醇麻醉并消毒。取脑，剥离部分皮层，剪成1～2 mm的组织块，用含0.25%胰蛋白酶的解剖液在37℃下消化30 min，然后将消化好的组织块移入种植液中终止消化，在种植液中用滴管吹打细胞，使之均匀分散，制成细胞悬液（其间，取少量悬液以台盼蓝染液记数细胞）。将细胞按1×105/ml的密度接种在培养瓶中，置于36℃10%的二氧化碳培养箱中过夜，12 h后更换含DMEM和胎牛血清的培养基，转移到96板中。

1.2．2诱发缺氧损伤培养后的皮质神经元悬液，按每孔0.2 ml接种于96孔细胞培养板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，神经元培养到第3天，换液时分别用浓度为0.008，0.04，0.2，1.0，5.0 mmol/L的连二亚硫酸钠进行缺氧处理，每个浓度重复7个复孔，继续培养24 h。按试剂盒说明向已处理好的96孔板中加入10 μl CCK-8溶液，继续培养24 h。450 nm波长下，在酶标仪上测定各孔吸光值（A值）。计算细胞存活率（%）=100%×（各实验组A值/细胞对照组A值）［6］。

1.2．3天麻素处理神经元培养到第3天进行氧化损伤时，加入含等量和倍量天麻素的连二亚硫酸钠培养液继续培养24 h，按细胞损伤相同方法另行计算细胞存活率。

1.3数据处理培养后的神经元分为对照组（不处理），缺氧损伤组（用连二亚硫酸钠进行化学缺氧损伤），天麻素低剂量组（与连二亚硫酸钠等量的天麻素处理后再行缺氧损伤）和天麻素高剂量组（连二亚硫酸钠倍量的天麻素处理后再行缺氧处理），重复观察各组皮质神经元的存活率，以存活率平均值±标准差进行计量，单因素方差分析比较组内和组间存活率差异的显著性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1连二亚硫酸钠导致的缺氧损伤不同浓度的连二亚硫酸钠造成皮质神经元的缺氧损伤（图1）有显著的时间依赖性（图2）和剂量依赖性（图3），尤以高浓度连二亚硫酸钠的损伤明显。但1.0 mmol/L和5.0 mmol/L连二亚硫酸钠导致的缺氧损伤并无显著性差异［7］。

2．2天麻素对皮质神经元缺氧损伤的保护作用等量或倍量的天麻素处理都能显著改善1.0 mmol/ L连二亚硫酸钠导致的皮质神经元缺氧损伤。高低剂量组间的作用并无显著性差异。见表1。

表1　天麻素对皮质神经元缺氧后细胞存活率的保护作用

图1　连二亚硫酸钠导致的皮质神经元缺氧损伤

图2　1．0 mmol/L连二亚硫酸钠致缺氧损伤的时间依赖性

图3　连二亚硫酸钠致缺氧损伤的浓度依赖性

3　讨论

神经元是神经系统的基本结构与功能单位，其对缺氧非常敏感，缺氧本身可造成神经元的损伤。缺氧是中枢损伤的常见原因。体外诱发缺氧损伤的办法有物理损伤和化学损伤。化学诱发细胞损伤具有便于定量的优点，本实验用连二亚硫酸钠作用于培养Wistar大鼠脑皮质神经元细胞，体外模拟神经元缺氧性损伤。实验中采用方便、快速、灵敏的CCK-8试剂盒结合酶标仪来检测目标产物的吸光值A，因为目标产物的数量与活细胞的数量成正比，所以该吸光值A可间接反映活细胞数量。实验结果表明，连二亚硫酸钠导致的皮质神经元损伤具有明显的时间依赖性和浓度依赖性。用等量或倍量的天麻素培养受损的皮质神经元细胞，培养24 h后发现与对照组相比两个剂量的天麻素组能显著改善1.0 mmol/L连二亚硫酸钠导致的皮质神经元缺氧损伤。

天麻是一种名贵中药，有效成分为天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、香草醛和天麻多糖等多种成分。相关研究发现天麻多糖可能是通过清除过量的自由基，降低膜脂过氧化产物的含量，从而起到抗氧化的作用。此外也有实验证实，天麻的抗氧化作用与强抗氧化剂维生素C的效果相当［8］。天麻素是临床上常用的神经系统用药，此前有多篇报道指出天麻素具有抗氧化的作用，但其作用机制不十分清楚［2，9］。目前的结果表明，天麻素具有对抗中枢缺氧损伤的作用，但是具体天麻中何种成分发挥该作用，以及天麻素对大鼠皮质神经元缺氧损伤的保护作用机制还需进一步研究。

［1］阳明，庞邦斌，银胜高.天麻传统规格等级与化学成分研究进展［J］.海峡药学，2015，27（3）：42.

［2］Chen PJ，Sheen LY.Gastrodiae Rhizoma：a review of biological activity and antidepressant mechanisms［J］.J Tradit Complement Med，2011，1（1）：31-40.

［3］于颖，樊光辉.天麻素的临床应用研究进展［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2012，10（9）：1117.

［4］田春梅.天麻的药理学研究进展［J］.哈尔滨医药杂志，2010，30（4）：71-72.

［5］胡金林.天麻的药理作用与临床应用［J］.中国乡村医药杂志，2009，16（3）：76，81.

［6］徐静，孙长凯，马辉.银杏叶提取物及银杏内酯B对体外培养大鼠神经元损伤的保护作用比较［J］.中国中药杂志，2010，35（1）：114-117.

［7］石瑞丽，胡金凤，孔令雷，等.瓜子金皂苷己对连二亚硫酸钠致氧糖剥夺/复供诱导PC12细胞凋亡的抑制作用［J］.中国药理学通报，2013，29（3）：333.

［8］黄丽亚，崔显念.天麻和维生素C对氟哌啶醇致衰老大鼠抗氧化酶表达作用的研究［J］.中国老年学杂志，2006，26（2）：1360-1361.

［9］Li M，Hu J，Li G，et al.The antagonism of rhizoma gastrodiae to lead-induced damage of hippocampus in rats［J］.Zhonghua Laodong Weisheng Zhiyebing Zazhi，2002，20（5）：331-333.［2015-12-17收稿，2016-01-15修回］

［本文编辑：刘一洋］

R282.7

B

10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.020

271000山东泰安，解放军88医院（袁红英，王永清）；264200山东威海，威海市市立医院药剂科（王中师）

王永清，Email：WYQ96307@126.com