奶粉中阴沟肠杆菌实时荧光PCR快速检测方法建立

周慧平　　唐连飞　　蔡文杰　　谭建锡　　朱中武　　禹思宇*

（1.湖南出入境检验检疫局　　湖南长沙　410004；2.湖南省畜牧兽医研究所）

奶粉中阴沟肠杆菌实时荧光PCR快速检测方法建立

周慧平1唐连飞1蔡文杰2谭建锡1朱中武1禹思宇1*

（1.湖南出入境检验检疫局湖南长沙410004；2.湖南省畜牧兽医研究所）

为建立快速有效的阴沟肠杆菌检测方法，根据Genbank中的阴沟肠杆菌Amp C酶基因序列设计引物和探针，建立了奶粉中阴沟肠杆菌实时荧光PCR快速检测方法。结果显示，该方法只对阴沟肠杆菌Amp C酶基因呈阳性反应，而对其他常见非阳性菌株基因组DNA均呈阴性反应，检测限为20 CFU/mL，对人工污染的奶粉样品检测验证了方法的实用性。建立的实时荧光PCR方法特异性强，灵敏度高，可以快速、准确检测奶粉中污染的阴沟肠杆菌。

阴沟肠杆菌；AmpC酶；实时荧光PCR；检测

1　　前言

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）属于肠杆菌科肠杆菌属，为革兰氏阴性粗短杆菌，能产生广谱Amp C酶和β-内酰胺酶（ESBLs），是一种条件致病菌，平时广泛分布于自然界中，于人和动物的肠道中普遍存在，既可引起食源性疾病，又是医院内感染和机会感染的重要致病菌［1］。在抗生素选择性压力下，阴沟肠杆菌的耐药机制不断发展，已产生多重耐药性，给临床治疗带来新的挑战［2-5］。近年由阴沟肠杆菌引起婴幼儿腹泻的发病率有逐年增高的趋势，作为婴幼儿食源性疾病的致病菌，阴沟肠杆菌已引起广泛关注。

食品中尤其是奶粉中阴沟肠杆菌的污染一直受到人们的关注。即使阴沟肠杆菌在婴儿奶粉中含量很低，联合国粮农组织和世界卫生组织的专家仍认为阴沟肠杆菌引起新生儿致病的危险性越来越大，是潜在的婴儿奶粉病原菌。因此专家们在进行婴儿配方奶粉中致病菌的风险分析时，将阴沟肠杆菌列为“B”类危险性生物因子［6-8］。

目前对阴沟肠杆菌不论是定量还是定性检测［9，10］，都需要经过两次增菌、分离和培养、纯化，生化鉴定等长达至少5 d的检测周期。这类方法耗时长，过程繁琐，已无法满足当今食品安全快速、准确的检测要求。本研究针对阴沟肠杆菌 Amp C酶基因设计引物和探针，建立了一种快速检测阴沟肠杆菌的实时荧光PCR方法，其灵敏度高和特异性好，能有效缩短检测时间，为奶粉中阴沟肠杆菌的风险监测提供新手段。

2　　材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

试验用菌株来源见表1。

表1　　试验用菌株来源

2.1.2试剂

阴沟肠杆菌分离琼脂 （ECIA）、肠杆菌增菌肉汤、胰化大豆蛋白琼脂：北京陆桥公司；细菌基因组小量提取试剂盒、GoTaq Probe qPCR Master Mix荧光PCR试剂盒：购自Promega公司；引物及探针：由宝生物（大连）工程有限公司合成。

2.2方法

2.2.1稀释与计数

取阴沟肠杆菌冻干粉接种于增菌肉汤，于37℃振荡培养22 h，在600 nm波长下测定培养液吸光度。当吸光度达到1.0时，取1 mL菌液涂胰蛋白大豆琼脂平板进行计数（浓度单位为CFU/mL），另取1 mL菌液用作模板DNA的提取。

2.2.2DNA的提取

取阴沟肠杆菌培养物，按细菌基因组小量提取试剂盒说明书方法进行DNA提取。

2.2.3引物设计

以耐药基因AmpC为检测靶基因，在GenBank中查找不同阴沟肠杆菌AmpC基因序列，经多序列同源性分析后找出保守区段，并以此保守区段设计引物和探针序列，用Blastn进行同源性匹配分析后确定引物和探针。上下游引物序列分别为：5’-TCAGCTGTTTGTCCGGGTTT-3’和3’-ATCATC CA G CTGCG CGAATA-5’；探针序列为：5’-FAMCAC CGA CGG CGA GAC CGA CTTT-TAMRA-3’

2.2.4反应体系和反应条件

反应体系（共 25 μL）：GoTaq Probe qPCR Master Mix（2×）12.5 μL；上下游引物（10mM）各1 μL；探针（10mM）1 μL；DNA 2 μL；ddH2O 5 μL。反应条件：95℃ 2 min；95℃变性 3 s，65℃30 s，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。

2.2.5特异性和灵敏度实验

取标准菌株阴沟肠杆菌和大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、产气肠杆菌、福氏志贺氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、幽门螺杆菌，制备DNA模板分别进行荧光PCR扩增，确定检测方法的特异性；取添加阴沟肠杆菌奶粉样品的增菌培养液，平板计数法测定结果为：阴沟肠杆菌（2×108CFU/mL），作10倍梯度稀释（菌液浓度为2×108-2），取1 mL提取DNA，再取每个稀释度的DNA 2 μL进行荧光PCR检测。

2.2.6样品的检测

参考吕敬章的方法［9］，分别无菌称取未污染阴沟肠杆菌的婴儿配方奶粉200 g，溶于预热到45℃的1800mL灭菌蒸馏水中。以ATCC 23355阴沟肠杆菌标准菌株为试验菌株，制成菌浓度为105CFU/mL的纯菌液，取20 μL分别加入到已溶解的奶粉中充分混匀，制成试验原样。照同样方法制作未污染阴沟肠杆菌的全脂奶粉、脱脂奶粉及婴儿水解奶粉的试验原样。各取50 mL的试验原样，每份试验原样加入等体积预热到45℃的灭菌蒸馏水，振摇使样品充分混匀，36℃±1℃培养18-22 h。应用上述建立的阴沟肠杆菌实时荧光PCR法检测未添加和添加阴沟肠杆菌阳性菌株奶粉样品：婴儿配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、婴儿水解奶粉，以评价该方法的实用性。

3　　结果

3.1实时荧光PCR特异性检测结果

以阳性标准菌株阴沟肠杆菌和非阳性菌株 （大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、产气肠杆菌、福氏志贺菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、幽门螺杆菌）制备DNA模板分别进行荧光PCR扩增，结果见图1。

图1　　实时荧光PCR特异性检测结果

图1显示，5株阴沟肠杆菌标准菌株均出现典型的荧光PCR扩增曲线，而所有对照菌株（非阳性菌株）均未出现扩增曲线，表明建立的实时荧光PCR反应体系适用于阴沟肠杆菌检测，且特异性良好。

3.2实时荧光PCR灵敏度试验结果

取添加阳性阴沟肠杆菌样品增菌培养液1 mL提取DNA，作10倍梯度稀释，取每个稀释度（2 μL）的DNA进行荧光PCR检测，结果见图2。

图2实时荧光PCR敏感性检测结果

图2显示，阴沟肠杆菌液在稀释倍数为10-7时仍然能检测到FAM荧光信号，表明阴沟肠杆菌荧光PCR扩增体系能检测出浓度为20 CFU/mL的阴沟肠杆菌。

3.3样品检测结果

应用上述建立的阴沟肠杆菌实时荧光PCR方法检测未添加和添加阴沟肠杆菌阳性菌株的奶粉样品，结果见图3。

图3　　人工污染样品中的荧光PCR检测

图3显示：未添加阴沟肠杆菌阳性菌株的奶粉样品均未检测到阴沟肠杆菌FAM荧光信号；添加了阴沟肠杆菌阳性菌株的奶粉样品均检测到阴沟肠杆菌FAM荧光信号。说明建立的阴沟肠杆菌实时荧光PCR方法适用于奶粉样品的快速检测。

4　　讨论

尽管人们对阴沟肠杆菌越来越重视，但对其生物学性状、毒力、传播途径和流行病学仍然了解甚少。目前对阴沟肠杆菌的研究主要集中在其耐药基因、耐药机制和临床分布方面［11-13］，对阴沟肠杆菌的快速检测未见新的研究报道，实际工作中往往采用传统的检测方法：增菌培养、分离、用VITEK全自动微生物鉴定系统和API进行生化鉴定［14-17］。这些传统的检测方法已经不能满足食品安全快速、准确检测的需求，而荧光PCR技术作为快速、准确的诊断手段早已广泛应用于食品中致病微生物的检测［18］。

5　　结论

本研究根据阴沟肠杆AmpC基因设计特异性引物及探针，成功建立了奶粉品中阴沟肠杆菌的实时荧光PCR检测方法，并且经过了实际样品的检测结果验证，填补了奶粉中阴沟肠杆菌检测方法及标准的空白。本方法具有快捷（全过程约30 h）、灵敏度高（20 CFU/mL）、特异性好的特点，适用于临床诊断、食品卫生监督及进出口食品中病原微生物检测等各个领域，可以为食品中新的致病菌检测提供技术支持，同时为食品安全风险预警提供依据。

［1］吴伟元，陈民钧，王辉.阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测［J］.中国临床药理学杂志，2001，17（2）：104.

［2］田磊，李莉，张蓓，等.阴沟肠杆菌产AmpC酶与ESBLs的研究［J］.中华医院感染学杂志，2009，19（15）：1942.

［3］顾怡明，张杰，俞云松，等.多重耐药阴沟肠杆菌流行情况及耐药机制研究［J］.中华医院感染学杂志，2004，14（12）：1321.

［4］康梅.阴沟肠杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的机制［J］.国外医学：微生物分册，1997，20（3）：21-23.

［5］杜廷义，周兵，马东亮，等.阴沟肠杆菌超广谱β-内酰胺酶检测及耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2001，11（2）：95-97.

［6］周文华，岳晓红.阴沟肠杆菌致小儿腹泻临床观察［J］.职业与健康，2005，21（3）：453-454.

［7］周文华，王芳.新生儿化脓性胃炎141例临床研究［J］.中华医学论坛，2003，17（2）：7-8.

［8］世界卫生组织.食品安全和食源性疾病［EB/OL］.http：//www.who. int/mediacentre/factsheets/fs237/zh/index.html，2007-03.

［9］吕敬章，黄李华，赵贵明，等.奶粉中阴沟肠杆菌的检测方法研究［J］.食品科学，2009，30（2）：159-163.

［10］SN/T2552.7-2010乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第7部分：阴沟肠杆菌检验［S］.

［11］Mokracka J，Koczura R，Pawlowski K，et al.Resistance patterns andintegroncassettearraysoftheEnterobactercloacae complex strains of human origin［J］.J Med Microbiol，2011，60 （Pt 6）：737-43

［12］张卫军.一起由阴沟肠杆菌引起的食物中毒的实验室检测分析［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（2）：425-426.

［13］李苏英.一起由阴沟肠杆菌引起食物中毒的实验室检测［J］.现代预防医学，2007，34（18）：3507-3509.

［14］刘锡光.现代诊断微生物学 ［M］.北京：人民卫生出版社，2002，375-476.

［15］Rudi K，Nogva HK，Moen B，et al.Development and application of new nucleic acid-based technologies for microbial community analyses in foods［J］.J International Journal of Food Microbiology，2002，78：171-180.

［16］MUYTIENS H L，ROELIFS-WILLEMSE H，JASPAR G H J. Qualityof powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae［J］.J Clin Microbiol，1988，26（4）：743-746.

［17］郝庆功，王丰坤，赵钦泰，等.从全脂加糖奶粉中分离出具有EIECO_（112）相同抗原的阴沟肠杆菌［J］.中国食品卫生杂志，1995，7（1）：37-38.

［18］Jonit FAO/WHO Food Standards Programme.Risk profile of Enterobactersakazakiiandothermicroorganismsinpowdered infant formula［R］.Geneva：WHO Headquarters，2004.

Rapid Detection of Enterobacter Cloacae in Powdered Milk by Real-Time PCR

ZHOU Huiping1，TANG Lianfei1，CAI Wenjie2，TAN Jianxi1，ZHU Zhongwu1，YU Siyu1*，
（1.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha，Hunan，410004；2.Hunan Institute of Animal&Veterinary Sciences）

The specific primers and probe for the real-time PCR according to the Enterobacter cloacae Amp C nucleotide sequence were designed and real-time PCR method was established to detect DNA of Enterobacter cloacae.The results showed that Enterobacter cloacae genes were positive by real-time PCR while other common non-positive strains genomic DNA was negative.Milk powder samples of artificial pollution test the practicality of the method is validated and the detection limit of Enterobacter cloacae were20CFU/mL.Theaboveresults demonstratedthatthemethodcouldbeusedforrapidly and accurately detect the Enterobacter cloacae contamination in powdered milk with high specificity and sensitivity.

Enterobacter Cloacae；Amp C；Real-Time PCR；Detection

TS207.4

E-mail：zhouhp@hnciq.gov.cn；*通讯作者E-mail：ysy2003de1@qq.com

湖南省科技计划项目（2014SK3082）

2015-11-12