鲫鱼温和气单胞菌的中药药浴组方研究

高桂生，史秋梅，张艳英，高光平，陈丹，韩红升，黄晓媛，缴宝丰，宋青春

（1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066600；2.秦皇岛粮丰海洋生态科技股份有限公司，河北秦皇岛066600；3河北皓海生物科技有限公司，河北秦皇岛066004）

鲫鱼温和气单胞菌的中药药浴组方研究

高桂生1，史秋梅1，张艳英1，高光平1，陈丹1，韩红升2，黄晓媛2，缴宝丰2，宋青春3

（1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066600；2.秦皇岛粮丰海洋生态科技股份有限公司，河北秦皇岛066600；3河北皓海生物科技有限公司，河北秦皇岛066004）

温和气单胞菌存在于淡水、土壤、淤泥、污水等环境中，有时在海水鱼类中也可观察到，世界各地均有分布［1］。该菌能引发罗非鱼、鲤鱼、鲫鱼等多种鱼类［2-6］及其他动物的疾病［7-9］。采用抗生素类化学药物控制这类疾病会容易导致病原菌产生耐药性［10-11］。相对而言，用中草药代替抗生素是水产病害防治中的一个发展方向［12］。有的研究［13-16］表明，中草药对嗜水气单胞菌等有较好的抑菌和杀菌效果。近年来，河北省秦皇岛市淡水养殖的鲫鱼、泥鳅、罗非鱼等有温和气单胞菌感染的现象。研究探讨了18种中草药对1株分离自鲫鱼病鱼体内的温和气单胞菌的抑菌作用，以期为由温和气单胞菌引发的常见气单胞菌病防治提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1材料

18味中药∶桉树叶、薄荷、五倍子、大黄、鱼腥草、沙棘、石榴皮、甘草、穿心莲、苏木、黄柏、马齿苋、石菖蒲、辣蓼、公丁香、乌梅、黄连、陈皮等均购自安国市神禾药材饮片有限责任公司。试验用菌株∶温和气单胞菌临床分离株分离自河北省某养殖场的病死鱼，经外部形态特征、生理生化鉴定、感染试验和16s rRNA基因序列测定等方法鉴定该菌株为温和气单胞菌。试验用鱼∶鲫鱼来自昌黎县碣石山市场，试验前在水族箱中驯养15 d，定时定量喂食和换水。

1.2中药液制备

取单味中药生药100 g，加入500 mL蒸馏水，浸泡1 h后在电炉上小火煮沸30 min，大约剩下浓缩液100 mL，过滤，浓度为1 g/mL，装瓶备用。

1.3药物敏感性试验

采用琼脂扩散法∶即在营养琼脂平板上，用无菌棉蘸取温和气单胞菌菌液涂抹在营养琼脂上，再用直径6 mm的打孔器在培养基上等距离打6个孔，用移液枪移取生药提取液的各种单味中药液200 μL，勿使其外溢，每种药液在平皿内做3个孔，置于28℃生化培养箱中培养18～24 h，量出抑菌圈直径，得出平皿每个单味中药三个孔的平均值。药物抑菌试验判断标准∶无抑菌环者为耐药、抑菌环直径在7～10 mm为低度敏感（低敏）、在11～15 mm为中度敏感（中敏）、≥16 mm的为高度敏感（高敏）。

1.4组方治疗试验

将敏感性高的中药组成组方再次进行药敏试验。

组方1∶五倍子、鱼腥草、乌梅、石榴皮、公丁香；组方2∶桉树叶、鱼腥草、乌梅、陈皮；组方3∶桉树叶、五倍子、大黄、乌梅、鱼腥草、薄荷。三个组方按比例取中草药后，按1∶5的比例加水浸泡1 h后在电炉上小火煮沸30 min，大约剩下浓缩液500 mL过滤，装瓶备用（原药1 g相当于药液1 mL）。

人工感染治疗试验∶驯养15 d的鲫鱼每10条一组，分为5组，试验设对照组，一组为健康对照组（不感染温和气单胞菌的鲫鱼），二组为感染对照组（感染温和气单胞菌，不给药），三四五组为组方1、组方2和组方3治疗组（感染温和气单胞菌的鲫鱼，然后用药治疗组）。将温和气单胞菌接种于普通肉汤中，28℃恒温培养8～12 h，用一次性注射器，每尾取0.5 mL菌液腹腔注射（细菌含量为2×106/ mL），使其感染温和气单胞菌而发病。试验分组及处理方法见表1。

表1　试验分组及处理方法

2　结果

2.1单味中药药敏试验结果

实验结果显示∶五倍子、鱼腥草、乌梅抑菌作用较强，为高敏；桉树叶、薄荷、大黄、沙棘、石榴皮、苏木、公丁香、陈皮有一定抑菌作用，为中度敏感；黄柏、黄连低度敏感；甘草、穿心莲、马齿苋、石菖蒲、辣蓼耐药。各种中草药抑菌直径见表2。

2.2三个中药组方药敏试验结果

表2　各种中草药抑菌直径

试验结果显示∶组方1抑菌直径达18 mm，组方2抑菌直径达20 mm，组方3抑菌直径达23 mm。

2.3三个中药组方药浴试验结果

根据药浴组方研究效果，用组方3（药物浓度均为1∶200）分别泼洒于第三、四、五组感染温和气单胞菌的黄颡鱼水体，每天定时换水换药。剩余的一、二2组，定时换水喂食，观察5组鱼的变化情况。感染对照组∶鲫鱼注射温和气单胞菌后反应迟钝、摄食量减少，严重者拒食；眼眶、鳃盖、鳍及肌肉等部位充血、出血；内脏出现各种病变，胆囊肿大，呈墨绿色，肝呈暗褐色，部分试验鱼体出现溃烂。3个组方治疗组的病鱼也陆续出现反应迟钝、摄食量减少，严重者体表溃烂，个别有死亡，但一段时间后陆续好转，药浴10 d后，感染鱼症状消失，没有发现死亡，其中以组方3效果最好。3组方药浴效果见表3。

3　小结

关于各单味中草药抑菌作用与功效∶采用纸片法和中药打孔法测定了中药抗菌效果，两种方法以中药打孔法效果好，即将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种检测菌的琼脂平板上或在孔内滴加中药液，纸片或孔中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片或孔周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片或孔周围抑菌浓度范围内形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度。结果表明∶五倍子、鱼腥草、乌梅抑菌作用较强；桉树叶、薄荷、大黄、沙棘、石榴皮、苏木、公丁香、陈皮、黄柏、黄连有一定的抑菌效果。该次试验通过药物敏感试验，确定了各种中草药对鲫鱼温和气单胞菌的抑菌效果，文献［17-18］也有类似报道。

表3　三组方药浴效果

关于各单味中草药组方抑菌作用与功效∶通过五倍子与黄连、大黄等以清热解毒功效为主的中药组成复方治疗鲫鱼感染的温和气单胞菌，再选用抑菌效果较强的中草药组成药浴组方对患病鲫鱼进行药浴试验，得到满意结果。资料也表明∶桉树叶可治感冒、流感、痢疾、肠炎湿疹，还有杀虫、杀菌等功效。五倍子含大量鞣酸，能凝固蛋白质，有较强的杀菌能力，对革兰阳性细菌和阴性细菌均有抑制作用，可用于防治鱼类白头白嘴病、黏细菌病、气单胞菌病、假单胞菌病、白皮病、赤皮病、疖疮病等。大黄抗菌作用强，抗菌谱广，有收敛、泻下、增加血小板、促进血液凝固等作用，用于烂鳃病、出血病及白头白嘴病等［19-20］。乌梅含柠檬酸，具有敛肺、涩肠、生津、安蛔的功效，用于治疗久痢滑肠、虚热消渴、胆道蛔虫症。鱼腥草对各种微生物生长有抑制作用，能调节动物机体本身的防御因素，提高机体免疫力。同时具有镇痛、止血、抑制浆液分泌、促进组织再生等作用，可用于防治草鱼细菌性烂鳃病。黄连有抑菌、消炎、解毒等功能，用于防治细菌性肠炎［21］。由上述单味中药组成的3个组方对人工感染温和气单胞菌的病鱼药浴时均具有较好的临床效果，与体外抑菌试验效果一致。但临床应用组方时，应该注意中药浓度、水体环境以及应用疗程，以发挥更好的效果。

桉树叶、乌梅、五倍子、大黄、鱼腥草、薄荷等对鲫鱼温和气单胞菌有较强抑菌作用，其中药组方药浴对人工感染发病鲫鱼有较好的治疗效果。

参考文献：

［1］Janda J M，Abbott S L.Evolving concepts regarding the genus Aeram onas:an expanding Panorama of species，disease presentations and unanswered questions［J］.Clin Infect Dis，1998，27（2）：332-344.

［2］蔡完其，孙佩芳.罗非鱼温和气单胞菌病的病原研究和药敏试验［J］.中国水产科学，2002，9（3）：243-246.

［3］刘敏，韩英.鲤温和气单胞菌的分离鉴定和药敏试验［J］.东北农业大学学报，2005，36（4）：486-489.

［4］陆文浩，陈辉，黄春贵.异育银鲫气单胞菌病原菌鉴定和药敏试验［J］.广东海洋大学学报，2009，29（1）：26-30.

［5］董传甫，林天龙，陈日升，等.日本鳗鲡败血腹水病病原研究［J］.水产科学，2002，21（1）：5-8.

［6］苏应兵，邹桂伟，袁科平.斑点叉尾鮰暴发性败血症病原的分离与鉴定［J］.淡水渔业，2006，36（5）：37-41.

［7］孙佩芳，蔡完其.中华鳖温和气单胞菌病的病原研究［J］.淡水渔业，1998，28（4）：3-5.

［8］刘金鹏，陈永林，胥哲.黑天鹅温和气单胞菌的分离与鉴定［J］.中国兽医杂志，2001，37（5）：56-57.

［9］叶雪平，顾金华，杨广智.牛蛙温和气单胞菌病病原及防治［J］.上海水产大学学报，2000，9（1）：78-80.

［10］张明，王建华，赵毅，等.20味中药对鳗弧菌的药敏试验［J］.动物医学进展，2005，26（8）：77-79.

［11］李茜，张懿瑾，华汝泉，等.23种中草药及复方对鲫肠道3种细菌的体外抑菌试验［J］.淡水渔业，2007，37（4）：7-11.

［12］程志斌，葛长荣，韩剑众.中草药有效成分对动物免疫功能的影响及其应用［J］.动物科学与动物医学，2002，19（1）：16-17.

［13］喻运珍，艾桃山，张萍香，等.嗜水气单胞菌对4种中草药和4种抗生素耐药性的比较研究［J］.内陆水产，1999（5）：5-6.

［14］王玉娥，邢晨光，王国良.5种海洋致病性弧菌对34种中草药敏感性的测定［J］.水产科学，2008，27（5）：221-225.

［15］毛芝娟，卓华龙，杨季芳，等.锯缘青蟹细菌性传染病的病原菌研究［J］.台湾海峡，2001，20（2）：187-192.

［16］金珊，王国良，赵青松，等.海水网箱养殖的鲈鱼皮肤溃疡病的防治药物［J］.台湾海峡，2000，19（2）：232-236.

［17］蔡完其，孙佩芳.罗非鱼温和气单胞菌病的病原研究和药敏试验［J］.中国水产科学，2002，9（3）：243-246.

［18］张海滨，张书霞.温和气单胞菌对10种中草药耐药性的初步研究［J］.信阳师范学院学报，2003，16（1）：39-41.

［19］温周瑞，刘慧集，骆敏，等.中草药对水产动物免疫作用研究进展［J］.水利渔业，2004（2）：1-3.

［20］王权，谢献胜.中草药在水产养殖疾病防治上的应用［J］.水产科技情报，2006，33（4）：163-165.

［21］吕永辉，王玉堂.渔药中的中草药［J］.中国水产，2006（7）：92-94.

资助项目∶河北省科技厅奖励性后补助项目（15926620H）；秦皇岛市科技局科技支撑计划（201401A067，201402B043）
作者简介∶高桂生（1964-），男，副教授，硕士，研究方向为水产养殖动物疾病防治.E-mail∶Ggs1964@163.com
通信作者∶史秋梅（1965-），女，教授.E-mail∶shiqiumei@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2016.03.016

收稿日期：（2015-09-03）