中药洗剂对兔膝骨性关节炎模型组织形态学及关节液中MMP-3的影响

雒永生，关永林，柳永明，赵继荣，何万庆，李晨旭，陈国栋甘肃省中医院，甘肃兰州730050



中药洗剂对兔膝骨性关节炎模型组织形态学及关节液中MMP-3的影响

雒永生，关永林，柳永明，赵继荣，何万庆，李晨旭，陈国栋
甘肃省中医院，甘肃兰州730050

目的：探讨中药洗剂对兔膝骨性关节炎（OA）模型组织形态学及关节液中基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的影响。方法：将新西兰大白兔40只，雌雄不限，体质量（2.50±0.10）kg，随机分为4组：A组（正常对照组）、B组（模型对照组）、C组（中药洗剂组）、D组（扶他林软膏组），每组10只。适应性喂养7天后，B、C、D组兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成OA及滑膜炎病变模型。术中注意不刺激关节软骨及滑膜；A、B组造模成功后每天用热水袋热敷膝关节，早晚各1次，C组造模成功后用中药洗剂热敷膝关节，早晚各1次，D组造模成功后用扶他林软膏涂抹后每天用热水袋热敷膝关节，早晚各1次，以上各组均外敷右膝关节表面，每次均为40分钟，治疗8周后，测关节液中MMP-3的含量。结果：1）中药洗剂、扶他林软膏都能明显改善兔膝关节功能活动；2）模型对照组血清MMP-3含量高于正常对照组（P＜0.05），中药洗剂可降低关节液MMP-3水平；中药洗剂组、扶他林软膏组与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但中药洗剂组与扶他林软膏组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：1）中药洗剂外敷与扶他林软膏外擦对兔膝骨性关节炎均有治疗作用；2）中药洗剂可降低关节滑液中MMP-3含量，对骨性关节炎具有治疗作用。

兔骨性关节炎；MMP-3；中药洗剂

膝关节是人体最大的负重关节，容易受到劳损和侵犯，膝骨性关节炎（Osteoar thritis，OA）是一种多发于中年以后的慢性膝关节退行性疾病，它是老年人疼痛、致残和生活质量下降的主要原因［1］。

骨性关节炎以关节软骨退变及软骨下骨反应性增生为特征，是发病率较高的骨关节疾病，骨性关节炎女性多于男性［2］，以关节疼痛、变形、增生，以及活动受限导致功能障碍为主要临床表现，X线片可见关节间隙狭窄，游离体形成等。OA发病机制目前尚不完全清楚，一般认为与衰老、创伤、炎症、肥胖、代谢障碍，免疫异常和遗传等多因素有关。OA临床发病率较高，目前对其治疗主要集中在药物镇痛、改善微循环、软骨修复方面，严重者可行人工膝关节置换术，治疗方法较多，但没有一种行之有效的治疗方法。该病亦缺乏有效的预防手段，只能缓解症状和延缓病变的进程。探索及研究该病的病因病机和中药治疗，以及有效预防对提高即将步入老龄化社会的我国人民的健康水平和生活质量都具有积极和深远的意义［3］。

骨性关节炎在疾病的发展过程中均有软骨的退化、破坏，故关节软骨成为骨性关节炎治疗研究的重要突破口。胶原的退化和OA的发病有密不可分的关系，因此，造成胶原裂解的基质金属蛋白酶（MM Ps）就成为重点研究和关注的对象，胶原酶基质金属蛋白酶-3（MM P-3）被认为是控制关节软骨中胶原纤维损害的重点目标，MM P-3也是近年来在O A发病机制中研究较多的指标之一。

在关节软骨中，MM P-3是最有效的Ⅱ型胶原裂解酶［4］之一。关节软骨中活化MM P-3的表达可诱发小鼠早发O A［5］。因此理论上MM P-3胶原酶的变化最能反映软骨基质中Ⅱ型胶原的代谢变化。MM Ps的功能主要为：几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracel lular matrix，ECM）成分，使其他MM Ps激活，形成瀑布效应，在胚胎发育、组织塑型中起着不可替代的作用［6］。在正常软骨中，软骨细胞会把合成的大量Ⅱ型胶原、蛋白多糖等物质分泌到ECM中，构成细胞外纤维网架，给细胞提供支持与保护。当软骨受损后，软骨细胞所产生的MM Ps的量发生了改变，导致ECM的产生与降解之间的平衡被打破，ECM被大量降解，软骨细胞周围的环境和胶原网络遭到破坏，导致OA的发生［7］。

MM P-3是与骨性关节炎关系密切的金属蛋白酶成员之一，它可由软骨细胞、滑膜细胞、纤维母细胞及中性粒细胞等产生，MM P-3能够裂解胶原分子中的酶，对胶原具有特异性，MM P-3是目前在软骨破坏中研究较多的胶原酶指标，在OA患者的关节滑液中明显增高。有研究表明［8］，在正常软骨细胞中有一种受体，这种受体可结合MM P-3，MM P-3受体系统在骨关节炎软骨系统中的功能失调导致了MM P-3水平增高和基质破坏。

正常情况下MM P-3只在表层软骨细胞中有表达，并通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白的相互作用，介导其内在转化和降解。而在OA关节软骨中，MM P-3不仅仅在表层，甚至在中层以及深层的簇积软骨细胞中均有较正常关节软骨细胞的过量表达。Freemont AJ等［9］观察到只有在骨关节炎病变部位的软骨才有Ⅱ型胶原的降解；龙厚清［10］认为胶原酶在O A软骨中出现的异常性表达增多，促进了软骨组织中胶原的降解，尤其是Ⅱ型胶原。MM P-3的表达明显增多直观反映了OA的病理性变化，可作为OA软骨检测的标志性酶［11］。

1　材料与方法

1.1实验动物健康新西兰大白兔40只，雌雄各半，体质量（2.5±0.5）kg，由兰州大学医学院实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（甘）0001。标准饲料喂养，室温15～25℃，实验前饲养1周，室温下自由进食、饮水不限。

1.2实验用药中药洗剂（甘肃中医药大学附属医院药房提供）；乌拉坦（上海精析化工科技有限公司，批号：DBI L09-20）；扶他林软膏（北京诺华制药有限公司，批号：X0704）；木瓜蛋白酶（河北博海生物工程有限公司提供MERCK公司，批号：000607）；生理盐水购于甘肃省中医院药房。

1.3主要试剂及仪器电热恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司DK8A D型）；普通手术器械（手术刀、组织剪、线剪、止血钳、持针器、缝合针、丝线等由甘肃省中医院实验室提供）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，批号：18860504）；系列可调节移液器及吸头（甘肃中医药大学实验室提供）；KDC-40低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；SK-1快速混匀器（常州国华电器有限公司）；RT-6000酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司生产）；可见723分光光度计（上海光谱仪器有限公司生产，批号：KJ0704100808）。

1.4实验方法

1.4.1动物分组采用单纯随机抽样方法将40只新西兰大白兔分为4组各10只：A组正常对照组；B组模型对照组；C组中药洗剂组；D组扶他林软膏组。

1.4.2造模方法适应性喂养7天后，按照日本头康彦等的兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶造成骨关节病变模型的方法对B、C、D组动物造模。将10%乌拉坦（0.5 g/kg）通过耳缘静脉注射到B、C、D组动物体内进行麻醉。待麻醉生效后，将兔右腿膝关节周围剃毛，然后用10%的异丙醇消毒皮肤，将膝关节弯曲，经膝关节正中进针，分别于实验第l、4、7天将1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5m L通过髌上韧带注入兔膝关节腔中。术中注意尽量不刺激关节软骨及滑膜。术后兔子自由饮水、摄食、活动。

1.4.3给药方法于最后1次造模1周后开始兔膝关节局部用药，2次/d，共计4周。中药洗剂组：将包好的中药洗剂放入锅中，加水以刚浸过药袋为度，放黄酒、食醋各三两，文火煮开后20分钟，充分挤压热药包中残留水分，保持药袋40～46℃，用薄毛巾包裹兔膝关节，绷带固定，各组兔均以右膝关节为用药和热敷部位，具体给药：A、B组每只用热水袋早晚各热敷1次，40min/次。C组中药洗剂早晚各热敷1次，40min/次。D组用扶他林软膏外涂后，热毛巾包裹的热水袋早晚各热敷1次，40min/次。

1.5观测指标敷药8周后耳缘静脉处注射空气30mL，快速处死兔，固定于解剖架上，双膝关节快速备皮消毒；于髌韧带附着点外上方约0.5cm处，沿韧带外缘向内向后进针，向关节腔内注射1.5mL蒸馏水，反复吸抽关节液数次后，抽取约2mL关节混合液，将关节混合液置4 000r/min离心10分钟，吸出上清液约0.3mL，装入试管中，置-20℃低温冰箱保存待测；将各组右膝关节囊切开，充分暴露关节滑膜，观察滑膜情况。

MM P-3浓度含量按试剂盒内说明书进行测定，用纯化的兔MM P-3抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入兔MM P-3，再与HRP标记的MM P-3抗体结合，形成复合物，彻底洗涤后加底物显色。用酶标仪在450nm波长下测定OD值，通过标准曲线计算样品中兔MM P-3浓度。

1.6统计学方法数据采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以（χ±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般状态观察及评分造模8周后，正常对照组兔精神状态良好，摄食正常，皮毛柔顺且有光泽，对外界刺激敏感，较灵活，无异常变化，膝关节活动正常；模型对照组兔精神差，无食欲，摄食少，毛色无光泽，柔顺性差，对外界刺激反应差，膝关节活动僵硬跛行，对外界刺激敏感性降低；中药洗剂组和扶他林软膏组兔精神状态较模型对照组好，毛色较模型对照组润泽，柔顺性好，对外界刺激敏感性可，膝关节活动较模型对照组明显改善，见表1—2。

表1　一般状态评分标准

表2　软骨退变大体评分（n=10）只

2.2关节软骨组织形态学观察及评分造模后的兔子均精神欠佳，食量减少，部分出现跛行，未做特殊处理。造模4天后精神、食量逐渐恢复。敷药8周后对各组右膝关节滑膜大体观察：正常对照组膝关节滑膜无肿胀、增厚；中药洗剂组和扶他林软膏组关节滑膜表面尚光滑，无肿胀或稍有水肿，无增厚，膝关节软骨外观色泽明亮、光滑湿润；模型对照组兔膝关节软骨发生显著形态学改变，失去原有光泽、颜色发黄、表面粗糙较软、滑膜充血、肿胀，滑膜增厚明显，局部可见软化灶，滑膜下纤维化明显，呈黄白色，骨质缺损，关节边缘可见骨赘形成，关节软骨具体评分标准见表3。

表3　关节软骨大体评分标准

2.3软骨退变程度评分中药洗剂能明显改善软骨基质状态、减慢软骨细胞的退变和软骨基质的降解，阻断或减缓病程的进展，对骨关节炎软骨退变起明显缓解和治疗作用，见表4。

表4　软骨退变程度评分只

2.4热敷散对兔关节液中MMP-3含量的影响正常对照组与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明造模成功；正常对照组、中药洗剂组、扶他林软膏组与模型对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；中药洗剂组、扶他林软膏组均能明显降低兔血清中MM P-3含量，说明中药洗剂及西药扶他林软膏在降低兔血清中MM P-3含量的作用是相同的，且中药洗剂对骨性关节炎中滑膜炎具有肯定的治疗作用，见表5。

表5　中药洗剂对兔关节液中MMP-3含量的影响

3　讨论

骨关节炎（O A）是一种最常见的慢性关节进行性退行性疾病。该病多劳累后加重，且病情较为复杂，疾病不同时期的病机亦有转化，治法方药也应有所偏重。

目前中医药治疗OA方法众多。中药外敷治疗骨性关节炎的报道较多，中药洗剂也已经作为一种主要的途径并且取得较好的临床疗效，能促进机体局部血液循环和淋巴回流，改善全身血运，促进机体新陈代谢活动，改善局部微环境，进一步改善全身功能；另一方面中药洗剂能疏通经络，调和气血，促进经络的调节活动功能。王铂欣［12］、眭承志等［13］用通经活络洗方熏洗并配合透明质酸钠治疗膝骨关节炎，起到内外兼治的作用，取得较好疗效。

本研究结果表明中药洗剂外敷与扶他林软膏外擦对兔膝骨性关节炎均有治疗作用；中药洗剂可降低关节滑液中MM P-3含量，对骨性关节炎具有肯定的治疗作用。中药洗剂由花椒、独活、伸筋草、透骨草、当归、红花、羌活等组成。花椒有祛风散寒，强筋止痛的作用，能行气活血、通经活络、消肿止痛，调节人体阴阳平衡，达到治疗膝关节痛证的目的；当归补血活血通经，能活血祛瘀、消肿止痛、舒经活络、促进组织的修复；透骨草、伸筋草搜风止痛，引药直达病所，再加独活、羌活、红花祛风散寒，舒经通络，全方共奏活血化瘀、消肿定痛、舒经活络之效［14］。本法是在辨证论治原则指导下，以治疗骨性关节炎为出发点，通过中药热敷使关节炎症状好转而OA症状逐渐减轻或消失。本方主要对临床常见的关节疼痛较剧烈、肿胀、屈伸不利，疼痛隐隐时作时休、形寒肢冷、面色白光白者尤为适宜。

中药洗剂内药物的成分能控制炎性介质和瘀血的渗出，降低骨内压，改善局部微循环，促进水肿吸收，阻止或减慢骨赘生成，减轻对关节的刺激，治愈或缓解症状，缓解疼痛，改善关节功能；热能可促进局部微循环，提高皮肤组织通透性，加速药物成分透皮吸收和炎性渗出物吸收，提高疗效，同时黄酒、白醋能活血化瘀，软坚散结，缓急止痛，进而改变局部组织理化环境，引起组织反应性改变，起止痛作用［15］。中药洗剂也可通过调节异常的细胞因子、清除过多的氧自由基而抑制滑膜炎症，改善关节内微循环，降低骨内及关节内压力，促进关节积液吸收，延缓关节软骨的退变过程，促进损伤软骨的修复，从而对O A起一定治疗作用。

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In fluenceof Herbal Lotion on MMP-3 in the Joint Fluid and the Histom orphology of the Rabbits with Osteoarthritis

LUO Yongsheng，GUAN Yonglin，LIU Yongming，ZHAO Jirong，HEWanqing，LIChenxu，CHEN Guodong
Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China

Objective:To explore the influence of herbal lotion on the histomorphology and MMP-3 in the joint fluid of the rabbitsw ith osteoarthritis（OA）.Methods:Forty rabbits，weighing（2.50±0.10）kg，were divided into four groups:A（normal control group），B（model control group），C（herbal lotion group）and D（Votalin ointment group），ten rabbits each group.Themodelsw ith OA and arthrosynovitisw ere prepared in the groups of B，C and D by injecting papain into articular cavity after feeding for seven days.Keep no irritations to arthrodial cartilage and synovium in the operations:hot-water bottles for external use were applied to the knees in the groups of A and B after successfully preparing themodels，once in themorning and evening，herbal lotionswereapplied to the knees in group C after the models w ere successfully prepared，once in the morning and evening，Votalin ointment w as smeared on the knees and hot-water bottles for external use in the group D，all the rabbits in the above groups accepted rightknee for externaluse，40m inuteseach time，the contentsof MMP-3 were detected in the joint fluid after treating foreightweeks.Results:1）Herbal lotion and Votalin ointmentcould obviously improve functionalactivities of rabbit knees obviously；2）The contents of MMP-3 in themodel control group were higher than these of normal control group significantly（P＜0.05），herbal lotion could decrease the levelsofMMP-3；therewere significantdifferences in the comparisonsamong herbal lotion group，Votalin ointment group and model controlgroup（P＜0.05），but there was no significant difference in the comparison between herbal lotion group and Votalin ointmentgroup（P＞0.05）.Conclusion:1）Herballotionand Votalinointmentforexternaluseshow therapeuticeffectsin the treatmentof OA；2）Herballotionscould decrease thecontentsofMMP-3 in thejointfluid，and itcould treatOA definitely.

the rabbitsw ith osteoarthritis；MMP-3；herbal lotion

R684.3

A

1004-6852（2016）03-0026-04

2015-02-22

雒永生（1983—），男，硕士学位，主治医师。研究方向：脊柱关节疾病的诊治。