御寒暖胃膏对慢性萎缩性胃炎修复机制的影响*

谢宇锋　陈　赟　冯　军△　杨宗保　吴云天　王曙辉



【实验研究】

御寒暖胃膏对慢性萎缩性胃炎修复机制的影响*

谢宇锋1陈赟1冯军1△杨宗保2吴云天1王曙辉1

目的研究御寒暖胃膏贴敷胃经穴对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜TNF-α、PCNA表达的影响，探讨御寒暖胃膏贴敷胃经穴对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜损伤修复的作用机制。方法大鼠随机分为正常组、模型组、御寒暖胃膏贴敷胃经穴组、药物对照组，采用综合干预方法复制慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠模型，光镜下观察胃黏膜组织的病理变化，采用酶联免疫分析法测定胃黏膜细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、增殖细胞核抗原( PCNA) 的表达水平。结果与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜组织病理学检查提示存在腺体萎缩和一定程度的细胞异型增生，大鼠胃黏膜细胞中TNF-α、PCNA表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，御寒暖胃膏贴敷胃经穴组和药物对照组大鼠胃黏膜组织的病理损伤得到明显修复，大鼠胃黏膜细胞中TNF-α、PCNA的表达水平明显降低(P<0.05)。结论御寒暖胃膏贴敷胃经穴可以促进CAG大鼠胃黏膜损伤的修复，该作用可能是通过调节胃黏膜细胞TNF-α、PCNA的表达水平来实现的。

御寒暖胃膏；穴位贴敷；慢性萎缩性胃炎；肿瘤坏死因子α；增殖细胞核抗原

慢性萎缩性喟炎(Chronic Atrophic Gastritis，CAG)作为胃癌的癌前病变，是慢性胃炎向胃癌发展的必经阶段，也是防治胃癌的关键节点。本课题组运用中医外治法经典著作《理瀹骈文》所记载的“御寒暖胃膏”贴敷胃经穴足三里、梁门干预慢性萎缩性胃炎患者，较好地改善了患者的临床症状，并在一定程度上促进慢性萎缩性胃炎胃黏膜腺体萎缩、细胞异型增生的逆转。为进一步明确御寒暖胃膏贴敷胃经穴对慢性萎缩性胃炎的作用，并阐述其可能的作用机制，为临床开展御寒暖胃膏贴敷胃经穴治疗慢性萎缩性胃炎提供科学的实验依据，本课题组开展了以下实验，具体介绍如下。

1　材料

1.1实验动物合格SD(Sprague-Dawley Rat)大鼠28只，雄性，清洁级，8周龄，体质量200～250 g，购于江西中医药大学实验动物中心(JZDWNO：2013-1056)。大鼠饲养于垫锯木屑的饲料笼中，每笼10只，控制室温22℃，相对湿度50%，采用自然光暗周期，自由饮水，检疫3周后分组实验。

1.2试剂与药品御寒暖胃膏组成为：生姜160 g，凡士林48 g，乳香3 g，没药3 g，川椒6 g，所有中药均购自深圳市福田区中医院中药房，并且于深圳市福田区中医院中药煎药房制成膏药；维酶素片(河北环海药业有限公司，批号：20120214)；N-甲基-N`-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)(日本东京化成株式会社)。

2　方法

2.1实验分组将28只大鼠按体质量排序，然后按随机数字表法随机分为4组，每组7只，分别为：正常组、模型组、御寒暖胃膏贴敷胃经穴组(下称：穴位贴敷组)、药物对照组。

2.2药品制备

2.2.1御寒暖胃膏的制备(1)膏药的组成：生姜800 g，凡士林240 g，乳香15 g，没药15 g，川椒30 g。(2)膏药的制备方法：①研磨药粉：将乳香、没药、川椒分别研碎成粉末(100目筛)，按份量称好以备用。②制备姜汁：将生姜榨成汁，倒入烧杯中，用酒精灯加热至沸腾。③溶化药物：首先加热融化凡士林，然后加入乳香、没药，并不断用玻璃棒搅拌至乳香、没药融化为止，然后与煮沸后的姜汁混匀，再加热至滴水不化。④冷却撒药：熄火待膏药温度降至60摄氏度时，将备好的药粉往膏中撒布并继续搅拌，冷却备用。

2.2.2维酶素灌胃液的制备将维酶素药片整片放入玻璃研磨皿中研磨成粉，按比例加入纯净水，将药物配成21.6mg/ml的溶液(人的维酶素给药剂量是2.4 g/d，人与大鼠的换算系数0.018，则大鼠的剂量为216mg/kg，根据大鼠体质量换算灌胃量)，然后按照大鼠的体质量，按1ml/ 100 g的用量予以灌胃，1次/日。

2.2.3MNNG溶液的制备MNNG溶液每周先用纯净水配成1 g/L浓度的储存液，避光4℃保存，用时将其配成150μg/ml的饮用液，并置于光屏蔽瓶中让大鼠自由饮用。

2.2.42%的水杨酸钠溶液的制备使用天秤称取水杨酸钠和纯净水，按1∶48的比例配成2%的水杨酸钠溶液，以备造模使用。

2.2.530%的乙醇溶液的制备使用天秤称取无水乙醇和纯净水，按3∶7的比例配成30%的乙醇溶液，以备造模使用。

2.3模型复制方法按照严茂祥[1]报道的综合造模方法，将SD大鼠分组后，除正常对照组外，其余3组大鼠采取严茂祥的综合方法复制CAG癌前病变动物模型，为期20周。①在饮水中加入MNNG溶液进行造模，让大鼠自由饮用，正常组自由饮用自来水。②2%水杨酸钠溶液灌胃：单日一次，按10ml/kg的剂量给大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1小时。③30%酒精溶液灌胃，双日一次，按10ml/kg的剂量给大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1小时。④对造模动物每日均用专用夹子夹尾一次，使其保持激怒、争斗状态，持续1小时。⑤饥饱失常法：2天足量喂食，1天停食，循环实施。

2.4干预方法

2.4.1正常组喂饲标准饲料，不予任何处理。

2.4.2模型组第21周开始，每天捆绑1小时，并予胶布贴敷肚子及双下肢，每只每天按1ml/100 g的用量经口灌服纯净水。

2.4.3穴位贴敷组①选穴与取穴：胃经穴分别选取足三里与梁门。②贴敷方法：第21周开始，每天将各组大鼠捆缚于鼠板,将膏药涂于所选部位上，直径为0.3cm，厚度为0.2cm，外用医用胶布固定，每日1小时。③每只每天按1ml/100 g的用量经口灌服纯净水。

2.4.4药物对照组维酶素溶液，按21.6mg/kg的药量给药，1次/日，每天捆绑1小时，并予胶布贴敷肚皮及双下肢。

2.4.5从第21周开始，各组按照上述方案共干预8周。

2.5动物处理及标本采集

2.5.1动物处理经过8周干预结束后，大鼠处理前24h禁食不禁水，称量体质量后，在超净工作台下，按照0.3ml/100 g的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹部朝上置于鼠板上，用手术刀迅速打开大鼠腹腔，取出胃部。用眼科剪刀沿胃大弯剪开胃并翻转。用冰1%DEPC0.9%氯化钠溶液漂洗胃内容物，采用吸水纸将组织的水分吸干，取全小弯侧上至食管下至十二指肠的胃组织以备病理切片用；钝性分离胃窦黏膜，装在冻存管中，并用液氮冷冻，后储存于-80℃冰箱内以备用。

2.5.2病理切片标本采集从上述备用组织中取1cm×0.5cm 大小的组织块,0.9%的氯化钠溶液冲洗干净，然后将所取标本放入10%的甲醛溶液内固定24～48h, 常规进行石蜡包埋,不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，切片厚4μm。

2.5.3ELISA标本采集从上述备用组织中剪取胃腺部1cm×1cm大小的组织块，称重。用眼科剪将所取的组织块尽量剪碎，用移液管加入0.1M冰PBS缓冲液(按：组织块重量∶缓冲液体积=1∶9)。将所获得的组织混悬液使用匀浆机在冰上以10000r/min研磨成10%的组织匀浆(匀浆时间10s/次，间隔30s，反复3～5次)。将所获得的匀浆液移入干净的离心管中，并使用冷冻离心机，以4℃、3000rpm离心15min。然后将离心管内的上清液转移至新的洁净EP管中，放入-80℃冰箱备用。

2.6观测指标与方法

2.6.1胃黏膜的病理形态学将4组动物的胃体部切取5mm×7mm 大小的胃组织, 用10% 福尔马林固定液固定1周后, 常规石蜡包埋切片, HE染色, 光镜下观察。

2.6.2按照大鼠胃黏膜细胞TNF-α、PCNA的ELISA试剂盒使用说明书中的操作步骤进行操作。

2.7统计学方法所有数据均以均数±标准差表示，组间比较若满足正态分布且方差齐时采用单因素方差分析，组间不全相同时采用LSD进行两两比较，方差不齐选择Tamhane T2法进行方差检验和两两比较，若不满足正态性时采用秩和检验，采用SPSS17.0软件进行统计学处理。

3　结果

3.1各组胃黏膜组织病理学的变化情况图1-8光镜显示：正常组大鼠各层胃组织结构完整，上皮细胞、腺体大小形态均匀、排列有序，腺上皮与腺管分界清楚，固有腺及黏膜无扩张淤血，黏膜肌层无增生，未见病理性核分裂象(图1-2)。模型组大鼠黏膜层腺管形态及大小不规侧，存在囊状扩张的腺管，腺管结构紊乱，细胞核大小不等，在高倍镜下细胞核比例增大、浓染，细胞核呈杆状或类圆形，排列参差不齐，可见核分裂象(图3-4)。穴位贴敷组、药物对照组大鼠胃黏膜生长较模型组有所好转，其黏膜厚度与皱壁有所恢复，黏膜未见明显水肿、萎缩、炎症，腺体排列较整齐，腺体囊状扩张较少，未见明显萎缩，高倍镜下细胞核大小较均匀，排列整齐，未见病理性核分裂象(图5-8)。

图1　正常组(×100)

图2　正常组(×400)

图4　模型组(×400)

图5　穴位贴敷组(×100)

图6　穴位贴敷组(×400)

图7　药物对照组(×100)

图8　药物对照组(×400)

3.2各组大鼠胃黏膜TNF-α水平的比较与正常组相比，模型组的大鼠胃黏膜TNF-α明显增高(P<0.05)；与模型组比较，穴位贴敷组、药物对照组的大鼠胃黏膜TNF-α明显降低(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠胃黏膜TNF-α的比较(单位：ng/L)　

注：各组经方差分析示，F=53.66，P=0.000<0.05；与正常组比较，1)P=0.000<0.05；与模型组比较，2)P=0.000<0.05

3.3各组大鼠胃黏膜PCNA水平的比较与正常组相比，模型组的大鼠胃黏膜PCNA水平明显增高(P<0.05)；与模型组比较，穴位贴敷组、药物对照组的大鼠胃黏膜PCNA水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2各组大鼠胃黏膜PCNA水平的比较(单位：ng/ml)

组别样本数PCNA正常组72.88±0.38模型组74.55±0.281)穴位贴敷组组73.33±0.462)药物对照组73.81±0.372)

注：各组经方差分析示，F=22.27，P=0.000<0.05；与正常组比较，1)P=0.000<0.05；与模型组比较，2)P=0.000<0.05

4　讨论

御寒暖胃膏来源于清代中草药外治专家吴师机所著的《理瀹骈文》一书，该书大力推崇和发展膏药穴位贴敷这一外治法，记载“御寒暖胃膏，主治：胃伤，不思饮食，胸腹胀痛，呕哕恶心，噫气吞酸，怠惰嗜卧，并治腰背冷痛。用法：糁花椒贴中脘处，药物：生姜汁熬牛胶化开，以乳香、没药、黄丹收。”结合本方的配伍，不难看出本方具有温中和胃、活血祛瘀之效，且其所描述的症状与CAG的临床表现极为相似，虽然在中医学中并无CAG癌前病变这一病名，但早在《灵枢·经脉》就有记载：“足阳明之脉，是动则病，食则呕，胃脘痛”。本病病因主要与饮食不节、情志失司、素体虚弱、用药不当等因素有关。其病机为本虚标实、虚实夹杂，本虚为脾胃虚弱，邪实重在气滞血瘀，病位在胃，涉及脾、肾、肝，血瘀是本病发生的重要致病因素。因此，本病的中医治疗应在温中健脾、益气和胃的基础上，佐以活血化瘀。正与本方的攻效甚为相符。因此，本研究团队进行了大胆尝试，取得了较为理想的效果，并开展了相关的机制研究，以探索其作用途径。

慢性萎缩性胃炎其病理表现主要是以胃黏膜上皮和腺体萎缩、黏膜变薄或伴有肠腺化生、不典型增生为特征。CAG作为胃癌的癌前病变，其发生与胃癌的发生一样是受多基因调节、多步骤渐进的过程。在致病因素的持续作用下导致原癌基因、抑癌基因、DNA修复基因、细胞黏附分子、端粒、端粒酶、细胞周期调节因子和生长因子、受体系统等多个基因的结构和表达异常，这些改变的积累最终导致正常胃黏膜的细胞增殖和凋亡失去平衡，从而导致由正常上皮细胞转变成癌前病变甚至胃癌细胞。TNF之所以获得这样的命名，是因在最初发现时其是一种可致肿瘤快速出血坏死的物质，但后续的研究也提示其有促肿瘤作用。相关的研究认为TNF-α促肿瘤作用的机制是多途径的，可能与其过度表达并与受体结合，通过多条信号通路抑制细胞凋亡及促进细胞增殖有关，其中以NF-κB途径的研究较为深入，如：TNF-α可以调节端粒酶活性，通过NF-κB中的 p65导致人类端粒酶催化亚基 (hTERT)从胞质易位到核，最终推动细胞无限增殖[2]；通过 NF-κB途径诱导激活的胞苷脱氨酶大量产生，引起肿瘤相关基因如 p53和 c-myc基因突变[3]。TNF-α在肿瘤微环境中还可以导致 DNA损伤，增加致瘤性[4]。PCNA又称周期素，在启动细胞增殖中起着重要作用，参与细胞周期调控、复制、修复和凋亡等细胞分化的全过程[5]；此外，PCNA还是对DNA复制起重要调节作用的DNA聚合酶δ的辅助蛋白之一，其表达的异常，可以直接导致DNA的复制发生异常，使致畸率大大提高[6]。PCNA 表达主要见于细胞增殖周期中的S 期和G2 早期，过度阳性表达表明细胞处于活跃的增殖状态[7]。由此可见，TNF-α、PCNA作为调节细胞增殖与凋亡的重要活性因子，在肿瘤及癌前病变的发展过程中起着重要的作用。

本研究发现：在CAG大鼠的胃黏膜组织病理学检查提示存在细胞异型增生，大鼠胃黏膜TNF-α水平明显升高，PCNA呈现高表达。由此可见，CAG大鼠胃黏膜细胞的异常增生，可能与致病因素导致胃黏膜损伤，激发TNF-α等炎性因子的释放，并启动胃黏膜损伤修复有关。但长时间、多因素的作用下导致其过度表达，抑制细胞凋亡、促进细胞增殖，从而导致胃黏膜细胞处于活跃的增殖状态，表现为PCNA高表达，最终导致胃黏膜细胞异型增生。而穴位贴敷组和口服维酶素片可以在一定程度上逆转胃黏膜细胞的异常增生，且可以下调TNF-α、PCNA水平。国内外学者的研究显示，足阳明经穴对与胃相关的中枢及外周神经电生理、胃运动、胃分泌等均有明显调整作用[8，9]，以穴位为基础的干预方法，可以实现对胃肠道活性因子的调节，并实现胃黏膜的损伤修复[10～12]。在本课题组的早期研究也证实，与非经非穴点相比，御寒暖胃膏贴敷于胃经之足三里穴和梁门穴对CAG大鼠胃黏膜损伤的修复作用、血流量等的影响均有明显的差异[13]。所以可见穴位贴敷组可能是御寒暖胃膏作用于胃经穴，并激发经气并调节胃腑黏膜运动、分泌等功能，如本研究发现的下调TNF-α、PCNA表达，从而实现对CAG大鼠胃黏膜的修复，减轻胃黏膜的慢性炎症，最终达到抑制细胞过度增殖的作用。

综上所述，穴位贴敷组对慢性萎缩性胃炎癌前病变的干预作用机制明确，该方法值得临床推广应用。

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The Effect of Yuhan Nuanwei Paste on Repair Mechanisms of Chronic Atrophic Gastritis

XIE Yufeng1CHEN Yun1FENG Jun1△YANG Zongbao2WANG Shuhui1,WU Yuntian1

(1.Department of Acupuncture and Massage, Shenzhen Futian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangdong,Shenzhen 518000, China；2.Medical College of Xiamen University, Fujian, Xiamen 361005, China)

ObjectiveTo study the effect of Yuhan Nuanwei paste on TNF-α and PCNA in gastric mucosa of chronic atrophic gastritis (CAG) rat, and to explore the repair mechanisms of Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian on chronic atrophic gastritis and precancerous lesions of CAG rat gastric mucosal injury. MethodsThe rats were randomly divided into normal group, model group, Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian group and drug control group. By using the comprehensive intervention method to copy precancerous lesions of chronic atrophic gastritis rats' model, the index of the gastric mucosa injury in rats was observed under the naked eye. Then we observed the pathological changes of gastric mucosa tissue using enzyme-linked immunoassay determination of the expression of levels of tumor necrosis factor alpha in gastric mucosa cells (TNF-α), proliferating cell nucleus antigen (PCNA). ResultsComparing with the normal group, the model group's rat's gastric mucosa histopathological examination suggested the existence of gland atrophy and a certain degree of cell hyperplasia. The TNF-α and PCNA of rat gastric mucosa cells increased significantly (P<0.05). Comparing with the model group, the pathological damage obviously repaired of the Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian group and the drug control group. The TNF-α and PCNA of rat gastric mucosa cells significantly decreased (P<0.05). ConclusionThe Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian can promote the CAG rats' gastric mucosa damage repair, and the effect may be through adjusting the TNF-α and PCNA by gastric mucosa cells to come true.

Yuhan Nuanwei paste; Acupoint sticking; Chronic atrophic gastritis; Tumor necrosis factor alpha; Proliferating cell nuclear antigen

深圳市科技研发资金项目(No.JCYJ20130401105615482)

1.广东省深圳福田区中医院针灸推拿科(深圳 518000)；2.厦门大学医学院(厦门 361005)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.14.021

1003-8914(2016)-14-2034-05

(本文校对：杨丽霞2015-12-14)