氯化锂对U251胶质瘤细胞增值及GSK-3β蛋白表达影响的研究

伍世表广东省中医院脑病科，广东广州　510006

氯化锂对U251胶质瘤细胞增值及GSK-3β蛋白表达影响的研究

伍世表
广东省中医院脑病科，广东广州510006

目的 探讨GSK-3抑制剂（Licl）治疗脑胶质瘤的可行性及其机制。方法 于2015年1月—2015年6月期间将U251细胞经复苏处理后，经DMEM培养液并在接种后24 h达到连续传代对数生长期；分别将不同浓度的LiCl作用于U251细胞24、48 h；并对比不同浓度与不同作用时间下细胞的存活率、细胞周期改变情况以及GSK-3β蛋白的表达情况。结果 处理前，U251胶质瘤细胞的MTT值为1.0，不同浓度LiCl作用U251胶质瘤细胞24 h后，MTT值下降为0.45，与处理前比较结果显示药物组的MTT值显著低于未处理组，差异有统计学意义，P＜0.05，并呈剂量依赖关系。结论 LiCl抑制剂能明显抑制胶质瘤U251细胞株的增殖，而且能上调GSK-3β蛋白的表达。

氯化锂；胶质瘤；增值；蛋白表达

［Abstrct］Objective To investigate the feasibility of GSK-3 inhibitor（Licl）and its mechanism of treating brain glioma. Methods During the period from January 2015 to June 2015 will be U251 cell recovery after treatment by DMEM medium and at 24 h after inoculation to continuous passage of the logarithmic growth phase；then different concentration of LiCl in U251 cells and 24h，48h；comparison of cells at different concentrations and different action time on the survival rate，the changes of cell cycle and the expression of GSK-3 beta protein.Results Before treatment，U251 glioma cells MTT 1，different concentrations of LiCl in U251 glioma cells after 24 h，the MTT value decreased to 0.45，compared with the results before treatment showed drug group the MTT value was significantly lower than that in the untreated group，with statistical significance，P＜0.05，in a dose-dependent manner.Conclusion LiCl inhibitors can significantly inhibit the proliferation of U251 glioma cell lines，and can adjust the GSK-3 beta Protein expression.

［Key words］Lithium chloride；Glioma；Proliferation；Expression

胶质瘤是较为常见的原发性神经上皮肿瘤，其具有复发率高、致残率高、病死率高的特点，治疗难度非常大量，是继脑卒中后人类健康的第二大神经系统疾病［1］。该组所有研究均于2015年1月—2015年6月期间完成，以胶质瘤细胞株（U251）作为研究样本，分别将不同浓度的LiCl作用于U251细胞24、48 h；并对比不同浓度与不同作用时间下细胞的存活率、细胞周期改变情况以及GSK-3β蛋白的表达情况，以分析GSK3在胶质瘤治疗中的分子机制与可行性，并为今后的工作提供参考，现报道下。

1　资料与方法

1.1一般资料

该组所有研究均于2015年1月—2015年6月期间完成，采购U251细胞（上海细胞库），DMEM培养液、胎牛血清（FBS）购于美国 Gibco公司，Lithium chloride购于Sigma公司，GSK-3β兔抗人单克隆抗体购于CST公司，MTT购于AMRESCO公司，RNase A、碘化丙碇（Pl）购于BIOSHARP公司。

1.2方法

1.2.1噻唑蓝比色分析法 （MTT实验）用10%FBS的DMEM高糖培养液将U251细胞（对数生长期）制成悬浮细胞，并在无菌96孔板培养24 h后，分别加入200 uLmL的LiCL药物0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM，培养24、48 h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20 uL，继续培养4 h，吸走上清液，每孔加入150 uL的DMSO，避光振荡溶解10 min，检测波长490 mm时各孔的吸光值（OD）［2］。

1.2.2流式细胞术检测细胞周期以0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM LiCl药物作用U251细胞24 h后，将U251细胞消化制成细胞悬液，计数达到4×106个/mL，离心（1 000 r/min，5 min）弃去培养液；PBS洗2次，离心（1 000 r/min，5 min）弃去PBS，加入-20℃预冷的70%乙醇，置于-20℃固定过夜。离心（1 000 r/min，5 min）弃去固定液 ，PBS重悬2次×5min，离心（1 000 r/min，5 min）后弃去 PBS；采用PI染色液，室温避光染色5 min后上样，样品计数达2.0×104个细胞 ，FACSCalibur型流式细胞仪检测U251细胞在细胞周期各时相所占的百分比。

1.2.3细胞免疫化学 用10%FBS的DMEM高糖培养液将U251细胞（对数生长期）制成悬浮细胞，并接种于24孔培养板中，培养2 h后，每孔加1 mL培养液。培养24 h后，分别加入1 mL的LiCL药物0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM，培养至48 h时，吸走培养液，漂洗3次，加入500 uL 4%多聚甲醛，冰箱中冷藏20 min（4℃）；吸走4%多聚甲醛，并用PBS溶液洗5次，3 min/次。再按照SP免疫组化试剂盒进行操作，最后显微镜下观察、计数［3］。

1.3统计方法

数据采用EpiData软件进行双录入，数据分析采用SPSS 20.0统计学软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

结果显示药物组的MTT值显著低于未处理组，处理前，U251胶质瘤细胞的MTT值为1.0，不同浓度LiCl作用U251胶质瘤细胞24h后，MTT值下降为0.45，与处理前比较差异有统计学意义，P＜0.05，并呈剂量依赖关系（图1）。

图1　MTT比色法示各浓度细胞的吸光度值（P＜0.05）

3　讨论

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是真核生物中普遍存在的多功能丝氨酸/苏氨酸类激酶［4］。关于GSK-3最早的研究是将其作为糖代谢的主要限速酶，参与糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成的研究之中。近年来，随着研究的不断深入目前已经至少发现三条肿瘤转导通路与GSK-3密切相关，而且已经有研究证实通过调节GSK-3活性能够明显促进肿瘤细胞的生长或凋亡［5］。

该组研究中，U251胶质瘤细胞在不同浓度LiCl作用后，其增殖被明显抑制，并且抑制的程度与LiCl的浓度成正相关；而且U251细胞的细胞增殖期明显减少，GSK-3β蛋白表达明显增加，且增加的程度与LiCl的浓度成正相关；其细胞核增加的程度最为明显，结果差异有统计学意义（P＜0.05）。说明LiCl抑制剂能明显抑制胶质瘤U251细胞株的增殖，而且能上调GSK-3β蛋白的表达。证明LiCl抑制剂治疗胶质瘤具有可行性，能为下一步的机制研究提供初步的分子基础。关于GSK-3对肿瘤细胞抑制作用的机制尚无明确结论，有研究表明［5］GSK-3通过激活β-catenin相关基因，抑制了肿瘤细胞活性，促进肿瘤细胞的增殖。大量国内外研究发现［6］，LiCl是GSK-3的选择性抑制剂，经LiCl处理后GSK-3的磷酸化会明显增加，该文中利用LiCl抑制U251增殖与活性，从而促进肿瘤的发生［7］，主要是导致GSK-3β无法磷酸化细胞内的β-catenin，使β-catenin在细胞内聚集并移向胞核和T细胞因子和淋巴细胞增强因子相结合，激活下游基因，导致肿瘤细胞的增殖；下降或上调GSK-3β的活性可以影响肿瘤的细胞生长［8］。

综上所述，LiCl抑制剂能明显抑制胶质瘤U251细胞株的增殖，而且能上调GSK-3β蛋白的表达，但是关于其对胶质瘤治疗中的应用尚无明确依据，需要在今后的工作中通过大量临床研究以证实。

［1］梁林辉，王英成，韦锦学.利培酮在U251细胞中调节PI3K-Akt-GSK3β信号通路的研究［J］.中华医学遗传学杂志，2014，44（13）：11608-1162.

［2］L Liu，Z Dong，J Liang.As an independent prognostic factor，FAT10 promotes hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma progression via Akt/GSK3β pathway［J］.Oncogene 2014，13（7）：419-422.

［3］唐智，何正文，蔡皞.全反式维甲酸联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响 ［J］.现代生物医学进展，2013，5（2）：168-169.

［4］GH Sun，YD Liu，G Yu.Increased FAT10 expression is related to poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology&Medicine，2014，35（11）：19-25.

［5］Q Wang，YY Zhai，JH Dai.SAMD9L inactivation promotes cell proliferation via facilitating G1-S transition in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.International Journal of Biological Sciences，2014，14（7）：4416-4429.

［6］杨志英，邓志刚，伍健明，芹菜素对U251胶质瘤细胞生长及 p21、p53蛋白表达的影响 ［J］.中国医药生物技术，2013，13（37）：551-556.

［7］FM Gu，QL Li，Q Gao.IL-17 induces AKT-dependent IL-6/JAK2/STAT3 activation and tumor progression in hepatocellular carcinoma［J］.Molecular Cancer，2011，2（25）：275-279.

［8］Rui Chu，Guangquan Mo，Zhijun Duan.miRNAs affect the development of hepatocellular carcinoma via dysregulation of their biogenesis and expression［J］.Cell Communication& Signaling Ccs，2014，16（38）：187-192.

Study of Proliferation and Protein Expression of GSK3β by Lithium Chloride in Human Glioma Cell Line U251

WU Shi-biao
Department of encephalopathy，Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou，Guangdong Province，510006 China

R739

A

1674-0742（2016）07（b）－0028-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.20.028

伍世表（1982.7-），男，广东茂名人，硕士，住院医师，研究方向：脑胶质瘤。

（2016-04-16）