急性脑梗死患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平与TOAST分型的关系

邹成林　陈维钧　方璟　孙晓顺　赵亚洲　涂军



急性脑梗死患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平与TOAST分型的关系

邹成林陈维钧方璟孙晓顺赵亚洲涂军

目的 研究急性脑梗死(ACI)患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平变化,分析其与血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度及急性卒中治疗低分子肝素试验(TOAST)病因分型的相关性,初步探讨KLF2在ACI损伤中的作用机制。方法分别应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定45例ACI患者(ACI组)及45例健康体检者(对照组)的外周血单个核细胞KLF2 mRNA表达水平及血清TNF-α浓度,并按照TOAST病因分型标准将ACI组患者分为大动脉粥样硬化型(large artery atherosclerosis,LAA)20例、小动脉闭塞型(small artery occlusion,SAO)25例。分析各组KLF2 mRNA水平的差异,以及KLF2 mRNA水平与TNF-α浓度及TOAST病因分型的相关性。对ACI患者进行神经功能缺损评分(NIHSS),并比较不同程度神经功能缺损的KLF2 mRNA水平。结果ACI组外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),并且KLF2 mRNA表达水平与血清TNF-α浓度之间存在相关性(r=-0.594,P<0.05)。LAA型KLF2 mRNA水平低于SAO型和对照组,SAO型KLF2 mRNA表达水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ACI组外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平与NIHSS评分存在相关关系(r=-0.487,P<0.05)。结论ACI患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平降低,LAA型患者和神经功能缺损患者降低更显著。KLF2 mRNA与血清TNF-α浓度呈负相关,KLF2可能通过介导ACI的炎症反应在其发病中产生作用。

急性脑梗死; KLF2; TOAST分型

急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)是由于血管壁局部病变导致血管痉挛、狭窄或闭塞引起的局部脑组织缺血、缺氧而引起的细胞死亡,其常见原因是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)。目前认为AS是一种炎症性疾病,近年研究发现Küppel样转录因子2(KLF2)具有防止血栓形成、抗炎、稳定血管内皮等作用,在抗AS方面具有重要的作用[1]。本研究应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定ACI患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平变化,同时用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,分析KLF2 mRNA水平与血清TNF-α浓度、急性卒中治疗低分子肝素试验(TOAST)分型、神经功能缺损程度相关性,初步探讨KLF2在ACI损伤中的可能作用。

1　对象与方法

1.1研究对象来自我院神经内科2012年3月至2013年3月治疗的ACI患者45例(ACI组),其中男24例,女21例,年龄60～75岁,平均(62.6±10.8)岁。均签订知情同意书。所有患者均按照1995年全国第四届脑血管病学术会议通过的脑梗死诊断标准[2],并且经头部CT或MRI证实,均为首次发病,发病72 h内入院,既往无卒中病史,排除感染、恶性肿瘤、创伤等影响检测指标的患者。另选取同期我院体检中心45例健康体检者作为对照组,其中男20例,女25例,年龄58～72岁,平均(61.5±11.4)岁。按TOAST病因分型标准[3],结合临床资料及影像学检查,将ACI组分为大动脉粥样硬化型(large artery atherosclerosis,LAA)20例、小动脉闭塞型(small artery occlusion,SAO)25例。

1.2方法

1.2.1主要试剂及仪器:ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司),淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液学研究所),全血RNA提取试剂盒(美国OMEGA公司),TRIzol RNA试剂(TIANGEN公司),逆转录试剂盒(promega公司),东胜PCR仪,2000型凝胶成像分析系统,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。KLF2引物系列:上游5’-GCACACTTGCAGCTACAC-3’,下游5’-AGGCTTCTCACCTGTGTG-3’,预期目的片段141 bp。GAPDH上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’,预期目的片段87 bp。

1.2.2血液生化指标检测:ACI组住院次日清晨、对照组当日清晨抽取空腹肘前静脉血7 ml,其中2 ml置于EDTA-K2抗凝管中,检测空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),余5 ml用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,置于-70℃冰箱保存备用。

1.2.3RT-PCR检测KLF2 mRNA表达:将分离出的单个核细胞用TRIzol RNA分离液一步提取总RNA，OD260/OD280应在1.8～2.0，取一部分RNA于42 ℃下用逆转录试剂盒制备cDNA，然后加入KLF2及GAPDH引物进行PCR，热循环条件为94℃预变性5 min，94 ℃热变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min。取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用2000型凝胶成像分析系统进行分析，以目的条带与GAPDH条带OD值的比值(ODR)表示KLF2 mRNA的相对表达量。

1.2.4临床神经功能缺损程度评分:按照美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)系统对ACI患者进行神经功能缺损评估,其中0～1分为正常,2～4分为轻度神经功能缺损,5～14分为中度神经功能缺损,≥15分为重度神经功能缺损。

2　结果

2.1ACI组与对照组一般资料比较2组患者的年龄、性别、高血压病史、糖尿病病史以及FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　ACI组与对照组一般临床资料比较(n=45)

2.2ACI组与对照组KLF2 mRNA表达水平的比较ACI组患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA表达水平低于对照组,TNF-α浓度高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ACI组外周血单个核细胞KLF2 mRNA表达水平与血清TNF-α浓度之间呈负相关(r=-0.594,P<0.05)。见表2。

2.3TOAST分型各亚型与对照组KLF2 mRNA表达水平的比较不同TOAST分型的KLF2 mRNA表达水平差异有统计学意义,进一步两两比较的结果显示LAA型KLF2 mRNA水平低于SAO型和对照组,SAO型KLF2 mRNA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。不同TOAST分型血清TNF-α浓度比较显示,LAA型及SAO型高于对照组,LAA型高于SAO型,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

组别KLF2mRNATNF-α(μg/L)对照组0.78±0.042.03±0.21ACI组0.33±0.103.64±0.23t28.4332.93P<0.01<0.01

组别KLF2mRNATNF-α(μg/L)LAA型(n=20)0.24±0.03*△3.83±0.10*△SAO型(n=25)0.42±0.04*3.44±0.18*对照组(n=45)0.78±0.042.03±0.21F1685.43892.15P<0.01<0.01

注:与对照组比较,*P<0.05;与SAO型比较,△P<0.05

2.4ACI患者临床神经功能缺损情况与KLF2 mRNA表达水平的相关性分析以NIHSS评分来反映患者的神经功能缺损程度。不同程度神经功能缺损各组NIHSS评分、KLF2 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关分析,ACI组外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平与NIHSS评分存在负相关关系(r=-0.487,P<0.05),即病情越重,外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平越低。见表4。

神经功能缺损程度NIHSS评分(分)KLF2mRNA轻型(n=10)2.60±0.700.43±0.04中型(n=18)8.61±2.640.23±0.01*重型(n=17)17.82±2.450.16±0.03*△F153.05303.10P<0.01<0.01

注:与轻型比较,*P<0.05；与中型比较，△P<0.05

3　讨论

Küppel样转录因子(KLF)是一类具有锌指结构域的核转录因子,它们对不同基因启动子的GT盒具有不同的亲和力,作为转录激活子,或作为转录抑制子调控特定基因的表达。KLF2为KLF家族中的成员,其与AS密切相关,在AS病变的多种细胞中参与转录调控各种因子。在AS小鼠模型中,当KLF2被敲除后其AS程度加重,斑块面积增大,提示KLF2在AS中具有保护作用[4]。有研究表明,与正常对照组相比,冠心病组单核细胞内的KLF2 mRNA表达降低[5]。ACI是一个极其复杂的病理生理过程,病因复杂多样,主要病因为AS[6]。因此本研究旨在探索KLF2在ACI过程中可能的作用。目前关于ACI与 KLF2关系的临床研究较少,本研究发现,ACI组的KLF2 mRNA水平低于对照组,说明KLF2在ACI发病过程中发挥一定的作用,但具体通过何种途径发挥作用尚不清楚。

动物实验研究发现,KLF2通过调节血脑屏障发挥脑保护作用,KLF2基因缺失小鼠缺血面积大,血脑屏障损伤严重,相反,KLF2基因过表达小鼠缺血面积小,血脑屏障损伤小[7]。本研究发现,ACI组TNF-α浓度较对照组增高,且外周血单个核细胞KLF2 mRNA表达水平与血清TNF-α浓度之间呈负相关。不同TOAST分型血清TNF-α浓度比较显示,LAA型及SAO型高于对照组,LAA型高于SAO型(P<0.05)。考虑KLF2可能参与脑缺血病理过程中对炎症因子的调控。Mahabeleshwar等[8]研究发现KLF2通过抑制核转录因子κB(NF-κB)及低氧诱导因子-1α的表达,从而抑制炎症及氧化应激对细胞的损害。在内皮细胞中炎症因子TNF-α通过NF-κB抑制KLF2转录激活剂肌细胞增强因子2(MEF2)可下调KLF2的表达[9]。

本研究采用TOAST分型标准,旨在观察不同分型ACI患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平是否有差异。研究显示,LAA型KLF2 mRNA水平低于SAO型和对照组,SAO型KLF2 mRNA表达水平低于对照组。提示KLF2在不同病因ACI的发病机制中权重不同。考虑LAA型卒中多由于大动脉堵塞所致,病灶大,AS斑块处的细胞凋亡和免疫炎症反应重,SAO型卒中主要是由于长期高血压、糖尿病等损伤导致的深穿支病变或弥漫性脑小动脉病变所致,梗死灶小[10]。

本研究进一步探讨了疾病严重程度,即NIHSS评分与患者外周血中单个核细胞KLF2 mRNA水平的关系。对2者进行相关性分析后发现,ACI组外周血中KLF2 mRNA水平与NIHSS评分呈负相关。ACI患者神经功能损伤越重,外周血单个核细胞中KLF2 mRNA水平越低。

综上所述,ACI患者外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平下降,且与血清TNF-α浓度、TOAST分型、神经功能缺损程度相关,ACI患者KLF2 mRNA水平越低,神经受损越严重。外周血单个核细胞KLF2 mRNA水平在脑梗死发生、发展过程中起重要作用,其可能通过介导ACI的炎症反应在脑梗死发病中有一定的作用,但其具体机制有待进一步研究。

[1]Atkins GB, Jain MK. Role of Küppel-like transcription factors in endothelial biology [J]. Circ Res, 2007, 100(2):1686-1695.

[2]中华神经科学会. 各类脑血管疾病诊断要点[J]. 中华神经科杂志, 1996, 29(6):379-380.

[3]Adams HP Jr, Bendixen BH, Kappelle LJ, et al. Classification of subtype of acute ischemic stroke. Definitions for use in a multicenter clinical trial. TOAST. Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment [J]. Stroke, 1993, 24(1):35-41.

[4]Atkins GB, Wang YM, Mahabeleshwar GH, et al. Hemizygous deficiency of Küppel-like factor 2 augments experimental atherosclerosis [J]. Cir Res, 2008, 103(7):690-693.

[5]Das H, Kumar A, Lin Z, et al. Küppel-like factor 2(KLF2) regulates proinflammatory activation of monocytes [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(17):6653-6658.

[6]Ross R. Atherosclerosis is an inflammatory disease [J]. N Engl J Med, 1999, 340(2):115-126.

[7]Shi H, Sheng B, Zhang F, et al. Küppel-like factor 2 protects against ischemic stroke by regulating endothelial blood brain barrier function [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013, 304(6):H796-H805.

[8]Mahabeleshwar GH, Kawanami D, Sharma N, et al. The myeloid transcription factor KLF2 regulates the host response to polymicrobial infection and endotoxic shock [J]. Immunity, 2011, 34(5):715-728.

[9]Kumar A, Lin Z, SenBanerjee S, et al. Tumor necrosis factor alpha-mediated reduction of KLF2 is due to inhibition of MEF2 by NF-kappaB and histonedeacetylases [J]. Mol Cell Bio, 2005, 25(14):5893-5903.

[10]王鸿轩, 王莹, 李晶晶, 等. 41例青年缺血性脑卒中病因、危险因素及影像学特点探析[J].中国神经精神疾病杂志, 2008, 34(8):479-482.

Study on the expression of KLF2 mRNA IN peripheral blood mononuclear cells in patients with acute ischemic infarction and its relationship with TOAST subtypes

ZOUCheng-lin,CHENWei-jun,FANGJing,SUNXiao-shun,ZHAOYa-zhou,TUJun.

DepartmentofInternalMedicine,theSecondPeople’sHospitalofJingzhou,Jingzhou434000,China

ObjectiveTo observe the level of KLF2 mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) in patients with acute cerebral infarction(ACI), and to analyze the relationship of KLF2 mRNA with the serum level of TNF-α and TOAST subtypes.MethodsForty-five patients with ACI (ACI group) were admitted in our hospital, and other forty-five healthy subjects were chosen as control group. ACI group was divided into large artery atherosclerosis (LAA) group(20 cases) and small artery occlusion (SAO) group (25 cases) according to TOAST classification criteria. The level of KLF2 mRNA was compared among the groups. The correlation of KLF2 mRNA level with the serum level of TNF-α or neurologic impairment (NIHSS) scores was analyzed.ResultsThe level of KLF2 mRNA in ACI group was significantly lower than that of control group (P<0.05). The level of KLF2 mRNA in LAA type was significantly lower than that of SAO type and control group(P<0.05). The level of KLF2 mRNA in SAO type was lower than that of control group(P<0.05). The level of KLF2 mRNA was correlated with the serum level of TNF-α(r=-0.594,P<0.05) and NIHSS score(r=0.487,P<0.05), respectively.ConclusionsThe level of KLF2 mRNA in PBMCs of ACI patients is decreased, especially in the patients with LAA or with severe neurological dysfunction. The level of KLF2 mRNA is negatively correlated with the serum level of TNF-α, which might play a role in the pathogenesis of ACI through exerting inflammation injury.

acute cerebral infarction; KLF2; TOAST classification

434000湖北省荆州市，荆州市第二人民医院内一科

R 743.33

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.01.015

2015-03-11)