基于稻田土壤肥力及生物学活性的沼液适宜用量研究

黄继川， 徐培智， 彭智平， 于俊红， 涂玉婷， 杨林香， 吴雪娜, 林志军

(广东省农业科学院农业资源与环境研究所，广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室,农业部南方植物营养与肥料重点实验室，广州 510640)



基于稻田土壤肥力及生物学活性的沼液适宜用量研究

黄继川， 徐培智， 彭智平*， 于俊红， 涂玉婷， 杨林香， 吴雪娜, 林志军

(广东省农业科学院农业资源与环境研究所，广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室,农业部南方植物营养与肥料重点实验室，广州 510640)

沼液; 水稻; 土壤养分; 土壤酶活性; 微生物群落结构

1　材料与方法

1.1供试沼液与水稻品种

早稻和晚稻供试品种均为广东省农科院水稻研究所选育的“黄秀软占”。沼液pH为8.64、含N 628.1 mg/L、P 78.4 mg/L、K 458.8 mg/L。供试氮肥为尿素、磷肥为过磷酸钙、钾肥为氯化钾。

1.2供试土壤理化性质

试验于2013年在惠州市博罗县湖镇进行，试验前采集水稻田0—20 cm耕层土壤测定土壤养分含量与酶活性。其中，有机质2.23%、碱解氮115.22 mg/kg、有效磷56.16 mg/kg、速效钾78.41 mg/kg、pH 5.03; 蔗糖酶活性3.01 Sucrose g/(kg·d)、脲酶活性184.19 NH3-N mg/(kg·d)、酸性磷酸酶活性3.81 phenol g/(kg·d)

1.3试验设计

试验设7个处理，分别为: 不施肥(CK); 常规施肥(N ∶P2O5∶K2O=1 ∶0.40 ∶0.87，施氮量为165 kg/hm2，以下简称CF); 施沼液200(BS200)、400(BS400)、600(BS600)、800(BS800)、1000 m3/hm2(BS1000)。每个处理设置3次重复，小区面积40 m2，小区间起30 cm宽、30 cm高的田埂并用尼龙膜阻隔，小区之间保护行宽2 m，保护行不施肥。水稻移栽前(早稻4月7日、晚稻8月7日)进行沼液灌施，一周后移栽水稻秧苗。在水稻收获期(早稻7月18日，平均气温30.1℃; 晚稻11月20日，平均气温19.3℃)每个小区采集0—20 cm土层10个样点混匀作为该小区土样，一部分自然风干供土壤理化性质测定，一部分在-20℃保存，1周内测定土壤酶活性，同时将同一个处理3个小区的剩余鲜土样混匀用无菌自封保鲜袋保存于-80℃供PCR-DGGE分析土壤微生物群落。

1.4分析方法

1.4.1 土壤理化性质及酶活性检测土壤有机质、碱解氮、有效磷、速效钾、pH按照鲁如坤主编的《土壤农业化学分析方法》测定[15]; 土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法[16]; 脲酶采用苯酚-次氯酸钠比色法[16]; 酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法检测[17]。

1.5数据统计分析

采用SPSS18.0和Excel 2003软件对试验数据进行分析。采用Quantity One软件对DGGE图谱的泳道和条带进行识别，分析不同样品之间可能存在的联系。

用Sorenson配对比较相似性系数(pairwise similarity coefficient，Cs)，比较不同样品DGGE指纹图谱的相似性。

Cs=2j/(a+b)

式中， a、b表示两个比较对象中的DNA条带数目，j表示a和b中相同的条带数量。

Shannon-Wiener多样性指数(H)、pielou均匀度指数(J)、物种丰度(S)等指标被用来比较各个样品的微生物多样性。计算公式如下:

J=H/Hmax=H/lnS

式中，pi是某个样品中单一条带的强度在该样品中的所有条带总强度中所占的比率; S是某个样品中所有条带数目总和。

2　结果与分析

2.1施用沼液对稻田土壤肥力的影响

2.2施用沼液对稻田土壤酶活性的影响

表1　收获期土壤理化指标

注(Note): 同列数据后不同字母表示同种水稻不同处理间差异达5%显著水平Valuesfollowedbydifferentlettersaresignificantlydifferentamongtreatmentsofthesamericetypeat5%level.

表2　施用沼液稻田土壤酶活性

注(Note): 同列数据后不同字母表示同种水稻不同处理间差异达5%显著水平Valuesfollowedbydifferentlettersaresignificantlydifferentamongtreatmentsofthesamericetypeat5%level.

从电泳结果(图1)可以看出，无论早稻和晚稻，各个处理间条带数目，条带的亮度和迁移距离都存在一定差异，且晚稻差异较早稻明显。各样品相似系数如表3所示，与CK处理相比，早稻和晚稻各处理均随着沼液用量的增加相似系数逐渐下降，说明随沼液用量的增加微生物群落结构与CK之间的差异变大，与CF处理之间的相似系数变化跟CK相似，随着沼液用量的增加相似系数降低。其中CF处理和BS200处理的相似度早稻为90.0%，晚稻为80.6%，这两个处理的微生物群落结构相似程度最高; 而早稻BS400与BS1000 处理的相似度最低，为65.8%，晚稻CF与BS1000处理相似度最低，为38.1%。

图1　稻田土壤样品细菌16S rDNA 片段PCR产物DGGE图谱(A: 早稻; B: 晚稻)Fig.1　DGGE profile of amplified 16S rDNA fragments from paddy soil samples of early rice(A)and late rice(B)

稻作季节Riceseason处理TreatmentCKCFBS200BS400BS600BS800BS1000早稻CK100EarlyriceCF88.9100BS20085.590.0100BS40088.287.685.6100BS60076.380.580.579.1100BS80076.378.480.680.885.2100BS100067.867.868.365.869.569.6100晚稻CK100.0LatericeCF74.3100.0BS20074.180.6100.0BS40060.762.463.1100.0BS60073.967.668.767.3100.0BS80069.667.268.668.673.7100.0BS100042.938.139.453.350.155.5100.0

此外，与早稻相比，晚稻施沼液处理与CK和CF之间的相似系数呈下降趋势，而且施用沼液的处理之间相似系数也呈下降趋势，说明连续施用沼液对稻田土壤细菌群落结构的影响作用具有一定的累积叠加效应。

如表4所示，早稻土壤细菌的多样性指数(H′)和辛普森指数(D)以及均匀度指数(J′)总体随沼液用量的增加而提高，至BS800处理最高，继续增加沼液用量后又下降，而物种丰度(S)以BS1000最高，CK最低。与CK相比，CF处理能够提高土壤细菌多样性，而施用沼液处理微生物多样性较常规处理进一步提高。晚稻土壤细菌的群落结构变化与早稻相似，随沼液用量的增加多样性指数(H′)和辛普森指数(D)提高，在BS600处理最高，均匀度指数(J′)在CF处理最高，继续增加沼液用量多样性指数(H′)和辛普森指数(D)以及均匀度指数(J′)下降，在BS1000处理最低。说明适量沼液有利于改善土壤微生物群落结构，而过量施用沼液则降低了土壤微生物的多样性指数、辛普森以及均匀度指数; 物种丰度(S)以BS600处理最高，其次为BS1000处理，而CK最低。

通过聚类分析表明，早稻CF和BS200处理聚为一类，而CK处理和BS400聚为一类，BS600和BS800聚为一类，而BS1000单独为一类。与早稻结果相似，晚稻除BS1000处理以外，沼液施用量相近的处理首先聚类，而BS1000处理单独聚为一类，与其他处理土壤微生物群落的差异最大，说明沼液用量的增加微生物群落结构逐渐发生变化，至最大用量时微生物群落与其他处理土壤微生物群落差异最大。

表4稻田土壤微生物多样性分析

Table4Microbialdiversitiesofpaddysoil

稻作季节Riceseason处理TreatmentH'DJ'S早稻CK2.8360.8820.75443EarlyriceCF2.9970.9020.78745BS2003.0930.9100.80347BS4003.0090.9020.77349BS6003.0990.9120.81046BS8003.1760.9200.81250BS10002.9490.8820.75051晚稻CK3.1390.9260.81148LatericeCF3.2830.9370.83152BS2003.3160.9360.82855BS4003.1970.9280.81351BS6003.3580.9390.82060BS8003.0670.9070.76954BS10002.9140.8850.71858

2.4土壤酶活性、微生物群落与土壤理化因子的主成分分析

对土壤酶活性、微生物群落以及土壤理化等肥力因子进行主成分分析(表5)。结果表示，早稻主成分分析前三个主成分的累计方差贡献率为89.208%(大于85%)，根据主成分分析原理，这三个主成分能完全反映土壤系统全部的变异信息。其中第一个主成分方差贡献率达到43.171%，在全部因子中占主要地位，代表了土壤pH、有机质和碱解氮、有效磷和速效钾以及微生物物种丰度等指标的信息，主要反映土壤系统理化性质和微生物丰度方面的综合指标(表6); 第二主成分的方差贡献率达到36.963%，在土壤肥力系统中占次要地位，主要代表了土壤酶活性和微生物群落结构方面的信息; 第三主成分方差贡献率为9.073%，主要代表了土壤有机质和脲酶的信息。

对晚稻土壤系统肥力因子的主成分分析表明，前三个主成分的累计方差贡献率为92.462%(大于85%)(表5)。第一主成分方差贡献率为62.792%，在土壤肥力系统中占主导地位，除脲酶以外其他指标在第一主成分中均有较高的载荷，因此第一主成分集中了绝大部分指标的信息，代表了土壤的整体综合肥力水平(表6); 第二主成分方差贡献率为20.975%，在肥力系统中也占有较为重要的地位，主要代表了土壤蔗糖酶、脲酶、微生物群落结构方面的信息，反映了土壤系统中的生理生化过程; 第三主成分方差贡献率为8.695%，代表了土壤脲酶活性与微生物物种丰度方面的信息。

3　讨论

沼液具有提高作物产量和品质[4,19]、提高土壤酶活性、改善土壤微生物群落结构[11-12]的效果。稻田施用沼液可提高土壤有机质、易氧化有机碳、腐植酸碳和胡敏酸碳等营养物质含量[4,13,19]，这与沼液中含有丰富的有机物质有关。本试验中，随沼液施用量的增加稻田土壤有机质含量提高，与CK相比早稻和晚稻有机质提高不显著，但与CF处理相比，早稻BS600至BS1000m3/hm2、晚稻施BS800和BS1000施沼液处理均表现为显著提高。沼液含有丰富的有机物质，但大多易迅速氧化分解而损失，而伴随大量氮肥施入促进了非自养微生物对有机碳的消耗，导致有机质累积量下降[20]。本试验随沼液施入氮素量大幅的增加，加速了土壤中非自养微生物活性，加剧了碳素消耗，导致随沼液投入的易氧化有机物质大量分解损耗，对土壤有机质的提升幅度降低，因此，与CK处理相比有机质提升并不显著。而CF处理由于氮素投入的同时无有机物的投入，导致土壤中原有碳素的消耗，从而引起土壤有机质下降，造成了CF处理有机质在早稻较BS600至BS1000处理，在晚稻较BS800和BS1000处理显著下降的现象。

表5　土壤主成分特征值

表6　土壤主成分的规格化特征向量

土壤pH受母质的影响很大，水肥管理也会对土壤pH产生影响[22]。本试验研究发现，早稻土壤pH随沼液用量的增加而下降，与唐华等[13]的研究结果相似; 而晚稻土壤pH则随沼液用量的增加而增加，与史一鸣的研究结果相似[23]，由于晚稻土壤为连续两季施用沼液，总体表现为施用沼液后pH呈上升趋势，这与沼液本身为碱性有关。CK和CF处理晚稻土壤pH明显下降，是否与早稻和晚稻土壤温度变化导致土壤中盐基饱和度或土壤胶粒上吸附性离子的解离度改变有关有待进一步研究，而晚稻施沼液BS600至BS1000m3/hm2处理pH与早稻较为接近，可能与沼液中有机物质含量的增加提高了土壤的缓冲性能而导致土壤pH相对趋于稳定有关。本试验施用沼液的处理中早稻产量以BS800最高(4925kg/hm2)，其次为BS1000和BS600，分别为(4685和4451kg/hm2)，晚稻以BS800最高，其次为BS600，分别为5040和4633kg/hm2，而BS1000处理产量为3876kg/hm2，较BS600和BS800处理显著下降(产量数据另文发表)，就水稻产量而言，沼液用量在800m3/hm2时可获得较高的产量。

沼液不仅含有丰富的营养物质还含有丰富的生物活性物质，适量施用沼液能够提高土壤酶活性，促进土壤内部生理生化过程的变化，诸多报道发现施用沼液提高土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性[7,11-13]，但沼液用量过高会降低土壤酶活性[24-25]。本研究发现，早稻与晚稻土壤脲酶和蔗糖酶活性均随沼液用量的增加呈先升高后下降的趋势; 土壤酸性磷酸酶活性在早稻规律性不明显，而晚稻随沼液用量增加而提高，说明施用沼液总体改善了土壤酶活性，这可能与沼液中含有大量的酶对土壤酶有增加的作用，而且沼液中易分解有机物质可为各种酶提供丰富的底物从而提高了酶活性有关[26]。此外，早稻试验土壤酶活性普遍较晚稻高，可能与早稻土壤温度较晚稻高有关，有待进一步研究验证。

土壤有机质、pH和矿质养分以及土壤酶和微生物主导的生理生化过程对土壤肥力起到重要作用。通过主成分分析发现，在早稻第一主成分累积方差贡献率最大，其中土壤矿质养分、有机质、pH以及微生物丰度具有较大载荷，说明土壤矿质养分和有机质、pH以及微生物丰度为影响土壤综合肥力的主导因子，主要以土壤理化因子和微生物丰度反映土壤的综合肥力; 第二主成分中土壤酶活性和微生物多样性指数均具有较大载荷，主要反映了土壤生物学活性方面信息，虽然不能代表土壤综合肥力，但由土壤酶及微生物主导的生理生化过程对土壤肥力具有明显影响。在晚稻的第一主成分中除土壤脲酶以外其他指标均具有较高的载荷，说明除脲酶以外的各个指标均对土壤综合肥力产生重要的影响，代表了土壤系统的综合肥力水平，第二主成分中蔗糖酶、脲酶以及微生物多样性指数具有较高的载荷，再次说明了土壤酶活性和微生物群落所主导的土壤生理生化过程在土壤肥力方面的重要性。此外, 通过早稻和晚稻试验数据主成分分析对比发现，连续施用沼液后除脲酶外其他指标在第一主成分因子中均具有较高的载荷，土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶以及微生物多样性对土壤肥力的贡献率与早稻相比均得到提高，说明连续施用沼液提高了各指标对土壤肥力的影响程度，尤其是提高了土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶以及微生物群落在土壤肥力中的贡献率，施用沼液在培肥稻田土壤方面具有较好的应用价值。

4　结论

1)土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾的含量随沼液施用量的增加明显提高，且连续施用具有一定的累积叠加效应; 土壤pH在短期(1茬)内表现为随沼液用量增加而降低，连续施用沼液2茬，施用量在600至1000m3/hm2时土壤pH得到改善。

3)施用适量沼液能够提高土壤微生物群落结构多样性，过多则效果降低。连续施用沼液对微生物群落结构的影响具有累积叠加效应。早稻和晚稻分别以施用800和600m3/hm2较为适宜，早稻1000m3/hm2以上、晚稻800m3/hm2微生物群落多样性下降。

4)综合考虑稻田土壤理化肥力因子、土壤酶活性以及微生物群落结构和产量，以及连续施用沼液的叠加效应，本研究条件下的沼液推荐用量在600到800m3/hm2之间。

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Biogas slurry use amount for suitable soil nutrition and biodiversity in paddy soil

HUANG Ji-chuan, XU Pei-zhi, PENG Zhi-ping*, YU Jun-hong, TU Yu-ting, YANG Lin-xiang, WU Xue-na, LIN Zhi-jun

(InstituteofAgriculturalResourcesandEnvironment,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences/GuangdongKeyLaboratoryofNutrientCyclingandFarmlandConservation/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizerinSouthRegion,MinistryofAgriculture,Guangzhou510640,China)

【Objectives】Biogas slurry is one of the byproducts of breeding industry, full of organic and inorganic nutrients good for crop growth, and must be recycled from point of ecological and economic sustainability. The effects of biogas slurry on the soil fertility and biological properties of paddy soil, and the suitable use amount for healthy soil ecosystem were studied in this paper. 【Methods】Field experiments were carried out in early rice and late rice in Boluo County, Guangdong Province in 2013. The experiment included two controls(no fertilizer and chemical fertilizer), and five levels of biogas slurry treatments(200, 400, 600, 800 and 1000 m3/hm2). The soil nutrient contents and enzyme activities in paddy soil were analyzed, and the soil microbial diversities and microbial structures were studied by PCR-DGGE method. 【Results】 With biogas slurry application increased, the content of soil organic matter, available N，available P and available K were enhanced, continuous application of biogas slurry showed accumulation effects. Soil pH was reduced in early rice experiment and enhanced in late rice experiment with the increase of biogas slurry application. The activities of soil sucrase, urease and acid phosphatase were enhanced by the application. The highest soil microbial diversities indexes were obtained when the biogas slurry applied amount was 800 m3/hm2in early rice and 600 m3/hm2in late rice. The similarity coefficient of soil microbial structure was decreased with biogas slurry dosage increased; the differentiation of microbial structure among treatments in late rice season was higher than in early rice season. Principal component analysis showed that the first principal component in early rice was the information of physicochemical properties and microbial abundance, while that in late rice was the soil physicochemical properties, soil microbial diversities and enzyme activities except urease. Biogas slurry application affected paddy soil physicochemical properties, especially biological activity after continuous use in early and late rice. 【Conclusion】Application of biogas slurry increases the contents of soil organic matter, available N, P and K, and improves soil enzyme activities, microbial diversities and microbial structures in application range of biogas slurry 400-800 m3/hm2. Comprehensively considering the soil fertility and biological health, as well as the accumulation effects of continuous application, 600-800 m3/hm2of biogas slurry is suggested for rice production in paddy soil ecosystem.

biogas slurry; rice; soil nutrient; soil enzyme activities; microbial structures

2014-11-13接受日期: 2015-08-21网络出版日期: 2015-09-29

广东省科技计划重点项目“广东省生态农业共性关键技术研究”(2012A020100003)； 广东省科技计划项目“广东省新型肥料与高效施肥工程技术研究中心建设(2014B090904068)”资助。

黄继川(1981—)，男，广西桂林人，博士研究生，副研究员，主要从事土壤微生物方面的研究。

Tel: 020-38469763， E-mail: huangkuang_2002@aliyun.com。*通信作者Tel: 020-38469763, E-mail: ytifei@aliyun.com

S141; S506.2

A

1008-505X(2016)02-0362-10