IdentifilerTM系统在产前染色体非整倍体快速检测中的应用

孙菊香 丁明霞 李学博 李华峰

1.山东省临沂市人民医院 (276000)；2.山东大学第二医院；3.山东政法学院证据鉴识省级重点实验室；4.山东省临沂市妇幼保健院

IdentifilerTM系统在产前染色体非整倍体快速检测中的应用

孙菊香1丁明霞2李学博3*李华峰4

1.山东省临沂市人民医院 (276000)；2.山东大学第二医院；3.山东政法学院证据鉴识省级重点实验室；4.山东省临沂市妇幼保健院

染色体异常是严重的先天性疾病，由于其不可治愈，给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，产前诊断作为二级预防措施一直是降低此类疾病发生率的主要途径[1]。短串联重复序列(STR)多态性符合孟德尔遗传规律，具有杂合性高、多态信息量大和高灵敏度等特点，已广泛应用于法医学亲子鉴定、个体识别及人类进化等研究中[2]。本研究利用IdentifilerTM体系对108例产前诊断常规样本检测分析，与常规细胞染色体培养方法比较，分析其在产前诊断筛查的效果。

1 资料与方法

1.1 标本来源

2013年1月～2014年12月在临沂市人民医院、山东大学第二医院，临沂市妇幼保健院接受遗传学产前诊断的样本，按照知情同意的原则取样共108例，其中羊水88例、脐血12例、绒毛8例。受试孕妇平均年龄38.5(22～46)岁，采集羊水标本者平均孕周为21.2(16～23)周；采集脐血标本者平均孕周为29.8(25～35)周；采集绒毛标本者平均孕周为10.6(9～12)周。以上受检孕妇具有以下产前诊断指征：唐氏筛查高风险52例，35岁以上高龄孕妇26例，不良孕产史28例，胎儿超声诊断畸形4例，有害物质接触史9例，夫妇中一方染色体异常3例，其中多例具有两种及以上产前诊断的指征。

1.2 标本采集

1.2.1羊水采集 在B超引导下，以21GPTC穿刺针经腹行羊膜腔穿刺，在羊水暗区最深处抽取羊水20ml，弃去最初的0.2～0.5ml，置入无菌管中，取3 ml进行STR分型检测，其余送实验室进行细胞培养行常规染色体核型分析。

1.2.2 绒毛采集 在B超引导下行经宫颈绒毛活检术，挑选吸出的绒毛置无菌生理盐水洗涤3～5次，倒置显微镜下去除血液、脂肪及蜕膜等组织，将绒毛剪成粥样。大部分接种至培养基培养后进行染色体核型分析，剩余部分用于STR分型检测。

1.2.3 脐血采集 B超观察脐带在羊水中的走向，确定脐带纵切面后，以22GPTC穿刺针经腹行脐静脉穿刺术。抽取脐血约3ml置无菌管中，1ml用于STR分型检测，2ml用于细胞培养后常规染色体核型分析。

1.3 染色体核型分析

每例样本均行常规染色体核型分析，具体方法见参考文献[3]。

1.4 STR分型检测

chelex法提取样本DNA，以IdentifilerTM试剂盒进行STR多位点复合扩增，反应体系为10μl，其中包含Reaction Mix 4μl，Primer 2μl，ddH2O 2.8μl，Taq聚合酶0.2μl和DNA 模板1μl。扩增循环参数为：95℃ 11 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，28个循环；60℃延伸60 min；4℃保存，每组均设置阴性及阳性对照。

1.5 数据分析

扩增结束后以ABI 3130XL型遗传分析仪检测，电泳结果用GeneMapper ID v3.2软件分析。STR基因座的不同峰表示不同长度的等位基因，峰面积代表扩增产物量。通过计算该STR位点的峰数量和峰面积比率进行判断，其中常染色体位点出现单峰无诊断意义，所得STR分型图谱均与已知分型结果比对。对两种方法的结果以SPSS 18.0统计学软件进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法对不同样本的检测情况

IdentifilerTM试剂盒对108例不同种类样本的STR分型检测，6h内均完成检测并获得结果，成功率为100%。常规细胞培养染色体核型分析过程中，12例脐血培养均获成功，成功率100%；88例羊水样本培养成功85例，成功率96.6%；8例绒毛均培养成功7例，成功率87.5%。所有样本培养成功率为96.3%。

2.2 两种方法对不同产前断指征样本的检测情况

两种方法均检出8例染色体数目异常，其中包括4例21三体；2例18-三体；1例13-三体；1例47，XYY，见表1；两种方法对染色体数目异常的检测结果符合率达100%。检测结果中染色体异常电泳图谱见图1。

表1 两种方法对不同产前诊断指征样本的检测结果

图A为1号21三体样本；图B为4号18三体样本

图1 部分样本的D21S11基因座检测结果

3 讨论

产前诊断是预防和干预出生缺陷的重要手段，传统的以染色体核型分析为主的细胞遗传学方法一直是公认的染色体疾病诊断的“金标准”。由于羊水穿刺属于有创性医疗技术，对孕妇和胎儿有一定潜在危险。为了保证羊水细胞活力提高培养的成功率，羊膜腔穿刺的时间一般限定在孕16～22周[4]。由于传统的细胞培养核型分析需要将羊水细胞培养至分裂中期，然后进行染色体制备，并进行人工镜下分析，其操作过程繁杂[5]，一旦出现细胞培养失败的情况，孕妇可能已经错过了再次复查的最佳孕周，导致产前检查及诊断的困难，给孕妇带来沉重的心理负担[1]。因此，建立简便、有效的孕期染色体核型分析样本筛查新方法，可提高常规核型分析的针对性和准确性，具有重要的临床意义。

染色体数目异常是临床上最主要的染色体疾病，约占出生缺陷患儿的80%～90%，其中主要系21、18、13、X与Y染色体非整倍体所致[6-7]。IdentifilerTM系统是美国应用生物公司开发的用于亲权鉴定的商业试剂盒，引物由5色荧光标记，可对包含13、18、21号染色体的15个STR基因座和1个性别位点进行检测，已广泛应用于法医学检案中。利用该方法，对样本STR基因座进行分型可确定胎儿是否存在主要染色体非整倍体。由于该技术可在羊膜腔穿刺后6h内完成检测，大大缩短了检验周期，对于细胞的分裂周期没有特殊的要求，标本来源丰富，无需细胞培养，因此非常适合产前诊断样本的快速筛查。由于样本羊水量可缩减至1～2ml，对羊水较少的个体更具临床优势[2，7]。

本研究利用绒毛、脐血和羊水细胞进行检测，均成功获得了STR分型结果，且与细胞培养核型分析结果一致，说明该方法具有较高的准确性。对于出现核型数目异常的个体，如果能够获得父母样本，还可以对数目异常的核型染色体来源进行分析，以便制定更好的医疗干预或预防措施。产前诊断检测样本的多样化具有重要的临床意义[4]，本方法对脐血和绒毛细胞检测同时有效，使检出率大大提高，扩大了样本选择的范围，受孕周限制小，提示该技术具有较高的临床应用价值。

当前常用的亲子鉴定试剂盒均包含有13、18、21号染色体的基因座，因此可作为传统细胞遗传学染色体核型分析的筛选及辅助检测手段，以提高检出率及准确性。但由于该方法只能根据某一基因座等位基因分析检测特定的染色体数目异常，对染色体结构平衡变异的检测仍存在局限性。因此，不断探索多个基因座的联合检测技术和试剂盒，可大大提高检测准确性并降低诊断成本，同时兼顾结构异常检测技术的创新，是该方法努力和发展的方向。

[1] 王树玉, 黄醒华, 贾婵维, 等. 国产探针荧光原位杂交技术用于产前诊断未培养羊水细胞染色体异常的研究 [J]. 中华妇产科杂志, 2009,44(7):492-497.

[2] Agarwal S, Srinivasan M, Phadke S. STR markers in clinics: A rapid prenatal diagnosis by quantitative fluorescent-pcr for aneuploidies [J]. Mol Cytogenet, 2014,7(Suppl 1 Proceedings of the International Conference on Human):I58.

[3] Xu AQ, Xia M, Liu JT, et al. Validation of quantitative fluorescent-PCR for rapid prenatal diagnosis of common aneuploidies in the chinese population [J]. Genet Mol Res, 2013,12(4):6379-6388.

[4] 张静引, 孙丽洲, 肖云山, 等. 改良荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用 [J]. 现代妇产科进展, 2009,18(6):442-445.

[5] Garcia-Sagredo JM. Fifty years of cytogenetics: A parallel view of the evolution of cytogenetics and genotoxicology [J]. Biochim Biophys Acta, 2008,1779(6-7):363-375.

[6] Weise A, Liehr T. Rapid prenatal aneuploidy screening by fluorescence in situ hybridization (FISH) [J]. Methods Mol Biol, 2008,444:39-47.2008:39-48.

[7] 许涓涓, 杜娟, 郑陈光, 等. 单管多重荧光定量PCR技术用于染色体非整倍体异常的产前诊断 [J]. 中华妇产科杂志, 2010,45(11):865-869.

[责任编辑：董 琳]

临沂市科技发展计划项目(NO.201413017)，山东省自然科学基金资助项目(ZR2014HQ018)

2015-08-07

2016-07-01

*通讯作者:lysjx2012@126.com