HRM技术在掌跖角化病KRT9基因致病突变检测中的应用

马 超 冯文华 韩维田

辽宁省计划生育科学研究院分子遗传实验室(沈阳，110031)

·技术与方法·

HRM技术在掌跖角化病KRT9基因致病突变检测中的应用

马 超 冯文华 韩维田*

辽宁省计划生育科学研究院分子遗传实验室(沈阳，110031)

目的：建立一种低成本、高通量、简便易行、准确可靠的检测掌跖角化病致病突变的方法。方法:应用高分辨率熔解曲线(HRM)方法检测掌跖角化病患者KRT9基因第一外显子突变情况，并与测序结果进行比较。结果:HRM方法能准确区分野生型和杂合型致病突变536T>C、548A>G，测序结果与 HRM 结果完全一致。结论:HRM方法能简单快速、准确经济地检测KRT9基因突变，能用于掌跖角化病患者的大样本临床初筛。

掌跖角化病；高分辨率熔解曲线；角蛋白9

掌跖角化病(PPK)是一组以手掌和足跖角化过度为特点的慢性皮肤病。大多为遗传性, 有家族史，按遗传方式可分为常染色体显性遗传类型,如表皮松解性掌跖角化病(EPPK, OMIM 144200)、Greither病、掌跖角化病伴发食管癌等,和较为罕见的常染色体隐性遗传类型,如Meleda 病、Papillon-lefevre综合征等。其中,EPPK较为常见, 表现为弥漫性、斑块状、有清晰红色边缘的角质增厚, 表面光滑、色黄, 局限在掌跖处的皮肤病变。Reis等[1-2]首次将与EPPK相关的基因定位在染色体17q12-q21上，并在位于该区域的角蛋白9基因(KRT9)中检测到一个点突变R162W。迄今为止，国内外研究人员已经在不同的EPPK家系中检测到了20多种不同的突变, 绝大多数突变集中于KRT9 基因第1外显子区域，此区域成为EPPK的突变热点区。目前，检测基因突变的方法很多，如PCR产物直接测序法、PCR-Taqman探针法、PCR-单链构象多态性分析法、突变特异性扩增系统等。这些方法存在着成本高、操作复杂或灵敏度低等问题，不利于临床大样本初筛。高分辨率熔解曲线(HRM)技术是近年来在传统突变检测方法的基础上发展起来的一种用于临床大样本已知突变初筛的新技术，它的作用原理是在PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进而进行基因分型[3]。为了建立一个简便、快速、准确、经济的掌跖角化病已知突变基因的大样本初步筛查检测平台，我们拟采用HRM 技术对来自于两个EPPK遗传家系的患者和正常人对照进行KRT9基因第1外显子的突变检测，并通过基因测序对HRM检测结果进行验证。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取来自于两个独立EPPK遗传家系的患者各2名和家系中正常人对照各1名。所有患者均在中国医科大学确诊为EPPK，排除其他相似的手足疾病。

1.2 仪器及试剂

高分辨率熔解曲线分析仪Light Scanner(Idaho Technology Council公司, 美国)，全基因组核酸提取试剂盒(TIANGEN公司,中国)，rTaq DNA聚合酶(TAKARA,日本)。采用Primer5软件设计KRT9基因第1外显子HRM引物，引物序列为：上游：5'GGTGGTATTCTGACTGCTAA 3'，下游：5' TATTCTCCAGGTCGTTGTT 3'，产物长度为115bp。

1.3 全基因组DNA 提取

抽取患者及正常人对照静脉全血，用TIANGEN全基因组核酸提取试剂盒提取6例全血样品中的DNA，用Nano Drop1000紫外分光光度计测定核酸浓度，并全部标准化为100 ng/μl。

1.4 PCR扩增

PCR反应在96孔板中进行，反应体系为20μl，其中包括基因组 DNA 1μl， LC green染料2μl。PCR退火温度为55℃。

1.5 HRM检测及分析

将PCR反应后的96孔板取出，每个反应孔中加入 1滴矿物油，离心后用Light Scanner检测各产物熔解曲线。分析方法采用HRM软件直接筛查法(Scanning法)，扩增子分型的相关参数为：温度范围84.7～88.5℃，敏感度-0.6。

1.6 样品测序

将各样品PCR扩增80μl后，送至北京博迈德生物有限公司测序。

2 结果

2.1 HRM检测

HRM的基因分型结果显示，根据熔解曲线(图1A)和熔解峰形(图1B)的差异，所有检测样品被分成3组，其中两个正常人为一组，家系1中的2名EPPK患者被分到同一组，家系2中的2名EPPK患者为第3组。每组曲线之间差异明显。结果说明检测样本中包含KRT9基因第1外显子的3种基因型。

2.2 测序

将6个样品进行测序，测序结果显示家系1中2名EPPK患者均存在KRT9基因536T>C杂合突变，家系2中2名EPPK患者均存在KRT9基因548A>G杂合突变，2名正常人均不存在KRT9基因突变(图1C)。测序分组结果与HRM分组结果完全一致。

A:熔解曲线图 B:熔解峰形图 C:测序结果图(野生型、536 T>C杂合突变和548 A>G杂合突变)

图1 样本检测结果

3 讨论

由于掌跖角化过度，患者的掌跖皮肤变得粗糙甚至龟裂，严重者出现行走疼痛，影响到正常的工作和生活。另外虽然掌跖角化病本身并不会致死、致残, 但这些家系患者对于一些危害严重的疾病如癌症、听力丧失及心力衰竭等具有遗传易患性[4]，因而掌跖角化病致病基因变异大样本检测平台的建立, 既能帮助临床准确诊断此类疾病，也能为基因治疗的研究和应用提供理论依据。

HRM技术是基于核酸的物理性质，通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化来分析核酸性质差异的一种技术，它是在常规 PCR 基础上增加一种饱和染料LC Green，无需使用序列特异性探针，不受突变碱基位点和种类的局限，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、低成本、高通量、闭管操作等优点，可检测石蜡包埋组织块、血液等多种来源标本[5]。在利用 HRM 扩增含突变位点基因的过程中，由于突变位点不匹配、缺失、插入都会导致双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的 DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在突变位点。而且不同突变位点、杂合子存在与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此，HRM 分析能够有效区分不同突变位点与不同基因型。HRM技术既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析。所以，相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，HRM简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本。由于HRM对PCR产物没有破坏性，所以在通过HRM初筛后的PCR产物，还可以再进行测序来检测无法用 HRM进行基因分型和序列匹配的序列，因此，HRM可以减少95%以上的测序工作量，适用于临床大样本的初步筛查。

值得注意的是由于目前技术发展，该技术的应用定位于临床大样本已知突变的筛检，用此方法开展基因诊断和产前诊断不符合分子诊断技术方面的要求。该技术在人群筛查方面应当有应用价值，在遗传病基因诊断方面价值一般。

在本研究中我们确定了HRM方法检测KRT9基因第1外显子的两个常见杂合突变的实验条件，将已经确定的基因型作为标准化样本，可以直接应用于后续更多掌跖角化病患者的已知基因变异的初步筛查。另外在后续的研究中我们会继续添加已知的、寻找未知的掌跖角化病的致病位点，逐步完善以HRM技术为基础的掌跖角化病致病基因变异大样本初步筛查检测平台。

[1] Reis A, Kuster W, Eckardt R, et al. M app ing of a gene for epidermolytic palmoplantar keratoderma to the region of the acidic keratin gene cluster at 17q122q21 [J]. Hum Genet, 1992, 90:113-116.

[2] Reis A , Hennies HC, Langbein L, et al. Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK) [J]. Nat Genet, 1994, 6:174-179.

[3] Kramer D，Thunnissen FB，Gallegos-Ruiz MI，et al．A fast, sensitive and accurate high resolution melting (HRM) technology-based assay to screen for common K-ras mutations [J]. Cell Oncol, 2009, 31:161-167．

[4] Kelsell DP, Stevens HP. The palmoplantar keratodermas: much more than palms and soles [J]. Mol Med Today, 1999, 5(3):107-113.

[5] Tong SY, Giffard PM. Microbiological applications of high-resolution melting analysis [J]. Clin Microbiol, 2012, 50(11):3418-3421.

[责任编辑：王丽娜]

Application of HRM technology in detecting KRT9 gene pathogenic mutation of patients with palmoplantar keratoderma

MA Chao, FENG Wenhua, HAN Weitian

MolecularGeneticsLaboratory，LiaoningProvinceResearchInstituteofFamilyPlanning，Liaoning,110031

*Correspondauthor：hwtzzf@sohu.com

Objective: To establish a detecting method with low cost, high throughput, simple, accurate and reliable for detecting pathogenic mutation of patients with palmoplantar keratoderma. Method： The first exon mutation of KRT9 gene of patients with palmoplantar keratoderma were detected by high resolution melting (HRM) method, and the result then was compared with the result by sequencing. Result：HRM method had accurately distinguish wild type and heterozygous mutation 536T>C, 548A>G, which was consistent with sequencing results. Conclusion：HRM is a simple, fast, accurate and cost-efficiency method to detect the KRT9 gene mutations, so it is suitable for preliminary gene screening for patients with palmoplantar keratoderma.

Palmoplantar keratoderma; High resolution melting (HRM); Keratin 9 (KRT9)

辽宁省科学技术计划项目(2012225017)

2015-06-29

2016-07-12

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.08

*通讯作者：hwtzzf@sohu.com