Ang-1、Ang-2、MVD与复发性流产的相关性研究

张月莲 王 欢 窄静丽 王晶晶

1.山西医学科学院，山西大医院(太原， 030032)；2. 深圳盐田区人民医院3. 太原煤气化职工医院医院

·临床研究·

Ang-1、Ang-2、MVD与复发性流产的相关性研究

张月莲1王 欢2窄静丽3王晶晶1

1.山西医学科学院，山西大医院(太原， 030032)；2. 深圳盐田区人民医院3. 太原煤气化职工医院医院

目的：通过观察复发性流产(RSA)患者绒毛、蜕膜组织中血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)的表达及微血管密度(MVD)，探讨Ang-1、Ang-2与血管生成及RSA的关系。方法：选择2013年5 ～11月在山西大医院妇产科门诊行流产清宫术的RSA患者30例(RSA组)，既往有正常胎儿分娩史、自愿行人工流产的正常早孕妇女30例(正常组)。在人工流产的同时留取绒毛及蜕膜组织，经免疫组化SP法检测Ang-1、Ang-2 、CD34在两组绒毛及蜕膜组织中的表达水平，计数抗-CD34单抗标染的MVD，分析它们与RSA的关系。结果：①RSA组绒毛组织中Ang-1、Ang-2的表达及Ang-1/Ang-2比值均高于正常组(P<0.05)；蜕膜组织中Ang-1、Ang-2的表达均低于正常组(P<0.05)。两组蜕膜中Ang-1/Ang-2比值差异无统计学意义(P>0.05)；②RSA组中，绒毛Ang-1、Ang-2表达均高于蜕膜，Ang-1/Ang-2比值低于蜕膜(P<0.05)；正常组中，绒毛中Ang-1表达低于蜕膜(P<0.001)，Ang-2在绒毛、蜕膜组织中表达无统计学差异，绒毛Ang-1/Ang-2比值低于蜕膜(P<0.05)。 ③RSA组绒毛组织及蜕膜组织中MVD值低于正常组(P<0.05)。结论：Ang-1、Ang-2的过度表达可能是导致血管生成缺陷及自然流产的原因之一，Ang-1过度表达对血管生成缺陷的影响可能更大。

复发性流产；血管生成素-1；血管生成素-2；微血管密度；免疫组化

复发性流产(RSA)是妇产科常见病，发病率约为育龄妇女的1%～3%[1]，因其病因复杂，治疗较棘手，往往给欲生育的夫妇及家庭带来一定的精神、心理负担。RSA的病因可为胚胎染色体异常、母体黄体功能不全、子宫畸形、宫颈内口松弛等。但目前仍有近50%的RSA原因不清，由于妊娠从受精卵着床到胎盘形成及胚胎、胎儿的发育都与血管的生成及丰富的血液供应有着密切的关系，而血管生成素(Ang)于妊娠早期即有表达。为了探讨Ang与RSA的关系，本研究对RSA患者的绒毛及蜕膜组织进行了Ang-1、Ang-2、CD34的测定。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择自2013年5～11月在山西医学科学院山西大医院妇产科门诊行流产清宫术患者60例，其中RSA(≥2次自然流产)30例(RSA组)，正常妊娠行人工流产的妇女30例(正常组)。RSA组: ①孕妇年龄28.1±5.8(20～40)岁；②夫妇染色体检查无异常；③超声检查子宫发育无畸形；④甲状腺功能检查无异常；⑤无血栓形成倾向；⑥排除免疫及感染因素影响。 正常组：①孕妇年龄27.9±5.0(20～40)岁 ；②既往有正常分娩史而无不良孕产史；③本次妊娠无流产症状；④超声确诊早孕，可见胚芽及心管搏动。征得研究对象同意后在人工流产时留取标本。两组对象孕周、孕次、年龄经t检验无统计学差异。

1.2 实验方法

1.2.1 Ang-1、Ang-2、CD34表达的检测 RSA组因流产先兆行清宫术及正常组清宫后得到的新鲜绒毛和蜕膜组织，生理盐水漂洗，10%甲醛溶液固定12～24 h后石蜡包埋切片后，按试剂说明(北京博奥森生物科技有限公司)行免疫组化SP法检测Ang-1、Ang-2、CD34的表达 。采用病理图像分析系统(ScanScope CS, Gene Company Limited)扫描并截图，用Image-Pro Plus Version 6.0图像分析软件对每张切片截图的阳性区域进行Ang-1、Ang-2定量检测，测定阳性产物的积分光密度值(IOD值)。阳性反应越强烈，染色越深，IOD值则越大。

1.2.2 CD34阳性及微血管密度(MVD)的判定 采用SP法用CD34单克隆抗体工作液对组织血管进行免疫组化染色，显微镜下观察，以血管内皮细胞胞浆呈棕黄色为CD34阳性表达，根据CD34标记的血管内皮的数目计数微血管数量，将管腔<8个红细胞的血管或血管内皮细胞簇(包括单个内皮细胞着色)作为一个计数单位。MVD计算方法：按照Weidner[2]等的方法，每张切片在显微镜下放大400倍，计数5个视野微血管数目，取其平均值为该张切片的微血管密度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组组织中Ang-1、Ang-2的表达比较

两组绒毛组织的滋养层细胞、 间质细胞的胞浆内均有Ang-1、Ang-2的表达；两组蜕膜组织腺上皮细胞及基质细胞胞浆内存在Ang-1、Ang-2的表达。RSA组中，绒毛中Ang-1、Ang-2、Ang-1/Ang-2比值与蜕膜中相比有统计学意义(P<0.001)；在正常组中，绒毛中Ang-1、Ang-1/Ang-2比值与蜕膜中相比有差异(P<0.001)。RSA组绒毛中Ang-1、Ang-2、Ang-1/Ang-2表达高于正常组相应组织，而蜕膜组织Ang-1、Ang-2的表达均低于正常组相应部位，具有统计学差异。见图1～图4，见表1。

2.2 两组不同组织中MVD值

绒毛及蜕膜组织中MVD值在RSA组低于正常组(P<0.05)，且RSA组蜕膜组织的MVD低于绒毛组织(P<0.05)；正常组两组织中的MVD无差异(P>0.05)。见图5，表2。

表1 两组不同组织中Ang-1、Ang-2 IOD值比较

*表示有统计学意义

表2 两组不同组织中MVD的比较

组织 绒毛蜕膜tPRSA组20．1±1．514．2±3．211．10<0．05正常组29．8±4．027．9±12．60．67>0．05t2．572．14P<0．05<0．05

3 讨论

妊娠的发展依赖于胎盘绒毛的正常发育及血管生成，血管生成的调节需依靠血管生成刺激因子和抑制因子之间的平衡来调节。目前认为血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flt-1等的调节途径、Angs /酪氨酸激酶受体(Tie2)调节途径、Dll4(配体delta-like ligand 4)-Notch调节途径在血管生成中相互影响并发挥重要作用[3]。

Angs家族中成员 Ang-1、Ang-2均作用于内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie-2，可影响内皮的增殖、迁移及管状结构的形成，从而在血管形成中发挥重要作用，Ang-1是Tie-2的生理性配体及激动剂，其与Tie-2结合后, 使血管周围细胞和平滑肌细胞发生聚集, 有利于维持血管壁的完整性, 促进血管的重塑、成熟以及促进血管出芽及分支。Ang-2与Tie-2 结合的作用复杂，目前效应不清，认为Ang-2为Ang-1的天然竞争拮抗剂，其功能主要是与Ang-1竞争性地结合血管内皮细胞的Tie-2受体，从而诱导内皮细胞发生分裂、移位，使新生血管呈非出芽式生长[4]。布占红[5]等曾对米非司酮药流后绒毛及蜕膜组织进行了Ang-1检测，发现Ang-1在用药组蜕膜、绒毛组织中的表达均显著低于对照组，认为用药后使Ang-1的表达受到抑制，影响胚胎血管的正常生成，导致流产发生。也有研究发现[6]RSA患者的绒毛组织中Ang-1的表达显著增高。本研究中，RSA组与正常妊娠组相比，绒毛中Ang-1、Ang-2表达均增多，与上述研究结果相一致。同时发现绒毛组织中MVD值在RSA组明显低于正常组，推测Ang-1、Ang-2的过度表达造成绒毛血管形成障碍，影响胚胎发育可能是导致流产发生的原因。 本研究还发现，虽然RSA组蜕膜组织中Ang-1、Ang-2表达低于正常组蜕膜组织，但其Ang-1/Ang-2高于正常组，MVD低于正常组，提示血管的生成与Ang-1/Ang-2的比例有关，比例失调可能导致血管生成的减少，影响胚胎的营养供给，致使流产发生。但鉴于本研究中病例较少，对其比值大小及Ang-1、Ang-2的表达水平没能做出更具体的分析，有待于未来进一步的研究。

总之，妊娠期Ang-1、Ang-2在绒毛、蜕膜均有表达，Ang-1、Ang-2 调节途径可能参与了胚胎的发育、胎盘血管的形成、重建等过程，一旦Ang-1、Ang-2表达异常或平衡失调将会影响胎盘血管网发育，影响母胎之间气体和营养物质的交换，导致流产等发生。

[1] Carrington B,Sacks G,Regan L.Recurrent miscarriage:Pathophysiology and outcome[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2005,17(6):591-597.

[2] Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al . Tu mor angiogenes is:a new significant and in dependent pr ogn os tic indicator in early stage breast carcinoma[J].J Natl Cancer Inst, 1992, 84( 24) : 1875-1887.

[3] 孙晓佳，张月英，张雏东. 血管生成主要信号通路[J]. 国际肿瘤学杂志，2010，2(37)：95-97.

[4] Dunk C,Shams M,Nijiar S,et al. Angiopoietin-1 and angiopoietin- 2 activate trophoblast Tie-2 to promote growth and migration during placental development[J]. Am J Pathol，2000，156(6):2185-2199.

[5] 布占红，熊小琴 ，田菲，等.VEGF、Ang-1在米非司酮药流前后绒毛和蜕膜组织中的表达及意义[J].中国伤残医学杂志，2014，22(6)：52-53.

[6] 陈朝军.促血管生成素-1与反复自然流产的临床相关性分析[J].中国实用医药杂志 , 2014，9(24):123-124.

[责任编辑：王丽娜]

Study on the correlation between Angiogenin 1, Angiogenin 2，microvascular density and recurrent spontaneous abortion

ZHANG Yuelian1,WANG Huan2, ZHAI Jingli3, WANG Jingjing1

1.ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospital,Shanxi, 030032; 2.Thepeople'shospitalofYantiandistrictofShenzhen,3.Taiyuancoalgasificationworkerhospital

Objective: To explore the relationship between Angiogenin(Ang)1, Ang2，micro vascular density(MVD) and recurrent spontaneous abortion(RSA) by observing the expression of Ang 1, Ang 2 and MVD in chorionic and decidua tissues of patients with recurrent spontaneous abortion. Method：From May 2013 to November 2013, 30 patients with RSA who came to Shanxi Dayi hospital for induced abortion were included in RSA group, and another 30 patients experienced abortion because of unwanted pregnancy or given birth to normally were included in normal group. Chorionic and decidua tissues of every patient had been collected. Expression level of Ang 1, Ang 2，CD34 in Chorion and decidual tissues were detected by immunohistochemical SP method, and the relationship between Ang1, Ang2，MVD and RSA was analyzed. Result: 1.Expression level of Ang 1, Ang 2 and Ang 1/ Ang 2 in chorionic tissue of patients of RSA group were higher than those of patient in normal group (P< 0.05). Expression level of Ang 1, Ang 2 in decidua tissue was lower than those of patients in normal group (P< 0.05). Ang 1/Ang 2 in deciduas tissue of two groups had no statistical significance (P>0.05). 2. In the RSA group, expression level of Ang 1, Ang 2 in chorionic tissue was significantly higher than those of patients in decidua tissue (P< 0.05),but Ang 1/Ang 2 was lower in decidua tissue (P< 0.05). In normal group, expression level of Ang 1 in chorionic tissue were significantly lower than those of patients in decidua tissue (P< 0.001), expression level of Ang 2 in chorionic tissue and in decidua tissue was same, but Ang 1/Ang 2 was lower in chorionic tissue (P< 0.05). 3. MVD in chorionic and decidua tissue of patients in RSA group was significantly lower than that of patients in normal group (P<0.05).Conclusion: The excessive expression of Ang 1 and Ang 2 in chorionic and decidual tissues in RSA group may be one of reason of angiogenesis defect and RSA. The excessive expression of Ang 1 maybe has heavier effect on angiogenesis defect.

Repeated spontaneous abortion;Angiogenin 1;Angiogenin 2;Microvascular density;Immunohistochemistry

2015-08-24

2016-06-18

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.08