甘草添加剂对绵羊支气管黏膜中杯状细胞数量及IgA分泌量的影响

张海燕（三河市畜牧水产局河北三河065200）

学术研究

甘草添加剂对绵羊支气管黏膜中杯状细胞数量及IgA分泌量的影响

张海燕
（三河市畜牧水产局河北三河065200）

本实验通过探究甘草的主要药理作用，对其药用价值和发挥药效的主要成分进行进一步研究，研究甘草添加剂对绵羊呼吸道系统免疫功能的影响。

甘草添加剂；支气管黏膜；杯状细胞；IgA

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.043

1　试验方法

1.1甘草粉的制备

称取150 g的甘草粉，置于烧杯中，第1次加1 000 mL蒸馏水浸泡1 h后煎煮，加热至沸后文火维持30 min，用4层纱布过滤，滤出煎液，滤渣用500 mL水量再煎煮2次，合并3次滤液，浓缩至500 mL，置4℃冰箱保存备用。将以上各溶液测定前分别用0.45μm微孔滤膜过滤，留滤液备用，用液相色谱法测定甘草酸含量。

1.2试验动物分组

将试验用绵羊随机分为三组，每组4只，分别为空白对照组、低剂量组和高剂量组。实验组绵羊每只每日早上饲喂甘草粉与精料混合物。空白对照组所饲喂的精料中不加甘草粉，连续饲喂30 d。

1.3杯状细胞体积及数量的检测

具体步骤：取材→固定→蒸馏水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→捞片→烤片→脱蜡→蒸馏水冲洗→用阿尔新蓝染液染色（30 min）→流水冲洗（2 min）→蒸馏水漂洗→苏木素复染→脱水→透明→封片→显微镜观察、照相。

1.4IgA分泌量的检测

1）放血处死绵羊，使用手术刀将肺组织切成1.5 cm×1 cm×0.3 cm左右的小块，用10%中性福尔马林固定24 h后修块到适当大小，再固定14 d。

2）将固定好的组织块用自来水冲洗2 d，然后进行脱水、透明、浸蜡，具体操作步骤如下：组织块→50%乙醇（2～3 h）→60%乙醇（2～3 h）→75%乙醇（2～3 h）→85%乙醇（2～3 h）→95%乙醇（1 h）→100%乙醇（40 min）→二甲苯、乙醇（1∶1）（30 min）→二甲苯（30 min）→52℃蜡杯（60 min）→55℃蜡杯（60 min）。

3）切片、捞片与烤片：将已溶化的石蜡倒入包埋框（小纸盒），迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中，冷却凝固成块状（即包埋），将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成8μm薄片，放到42℃温水中烫平，再贴到载玻片上，再放60℃恒温箱中烘烤24 h。

4）脱蜡：二甲苯I（15 min）→二甲苯II（10 min）→100%乙醇I（5 min）→100%乙醇II（5 min）→95%乙醇（5 min）→90%乙醇（5 min）→70%乙醇（5 min）。

5）冲洗：蒸馏水冲洗3次，2 min/次；pH 7.2 PBS冲洗3次，5 min/次。

6）阻断氧化酶活性：擦掉切片组织周围的液体，用PAP笔在组织周围画圈，放入底部盛有PBS的湿盒中，滴加3%H2O2阻断剂于组织上，室温避光20 min。PBS液冲洗3次，5 min/次。

7）抗原修复：热修复96℃，30 min，冷却后PBS 洗3次，2 min/次。

8）血清封闭：进口羊血清工作液滴加在组织上，37℃孵育30 min，甩掉血清，勿冲洗。

9）滴加一抗：滴加50倍稀释的一抗，37℃1 h，PBS（pH：7.2-7.6）洗3次，2 min/次。

10）滴加二抗：滴加生物素化兔抗鼠IgG，阴性对照组滴加等量PBS缓冲液代替一抗，20～37℃，20 min。PBS（pH：7.2-7.6）洗3次，2 min/次。

11）滴加试剂SABC，20～37℃，20 min，PBS （pH：7.2-7.6）4次，5 min/次。

12）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取蒸馏水1 mL，加试剂A 1滴，摇匀，再加试剂B和试剂C 各1滴，混匀后加至切片。室温显色30 min。

13）苏木素复染、各级酒精脱水，透明。14）中心树胶封片、显微镜观察、照相。

2　结果

2.1甘草品质鉴定结果

利用HPLC对野生胀果甘草粉的甘草酸含量进行测定，结果为3.1±0.6%，属于优质甘草。

2.2杯状细胞体积及数量变化

未饲喂甘草组与试验组相比，杯状细胞体积和数量都较小；实验组绵羊甘草饲喂量高的，杯状细胞数量和体积明显多于低剂量组。

2.3IgA分泌量的变化

未饲喂甘草组与试验组相比，阳性细胞数量明显偏少；与空白组相比，低剂量组阳性细胞明显较多；与低剂量组相比，高剂量组阳性细胞的数量又明显增多。

2.4图像分析结果

表1　杯状细胞及IgA图像IOD值测算结果（±s）

表1　杯状细胞及IgA图像IOD值测算结果（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

?

饲喂甘草组杯状细胞和IgA分泌量都显著高于空白组（P＜0.01）且高剂量组明显高于低剂量组（P＜0.01）。

3　结论

甘草作为饲料添加剂具有增加绵羊支气管黏膜杯状细胞体积、数量和IgA分泌量的作用。

4　讨论

本试验主要探究不同饲喂量的甘草添加剂对绵羊支气管黏膜杯状细胞的功能的影响。由于试验步骤多且繁复，因此必须要求在进行试验时要有严谨认真的态度，如所需试剂、仪器、各类缓冲液等必须提前准备好，以防造成时间上的冲突，在包埋过程中软蜡和硬蜡的比例、PBS缓冲液pH值的校正、滴加抗体的时间、湿盒的温度、DAB显色的时间等每个步骤都必须严格按照试验设计进行，否则都会影响试验效果。10%中性福尔马林比普通福尔马林对组织渗透性强，固定均匀对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩，能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色，经自来水冲洗6～24 h后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。

在阿尔新蓝染色检测杯状细胞体积及数量变化的试验中，由于阿尔新蓝带正电荷，属阳离子染料，在pH 2.5条件下，其阳离子可与酸性糖共轭物中的羧基或硫酸根结合而着色，但不能和核酸的磷酸根结合，其染色特点为特异性强，染色深而牢固，因此得出的试验结果阳性反应很明显。但免疫组化试验测IgA分泌量的试验却失败了两次，第一次是配制PBS缓冲液的过程中没有进行pH值校正，导致结果不明显。第二次是复染过程中忘了过盐酸（1∶1的盐酸酒精，6 s，脱色）。除了这些个人原因之外，这次实验具有很严格的时间性，所有步骤都是严格按照试验设计的时间和骤进行，在试验过程，我们相互配合，相互帮助，严谨认真，最终做出了较为理想的结果。

试验的不足之处在于我认为试验组取得不够完整，当甘草添加剂的饲喂量高于或低于某一个临界值时，其结果可能会发生变化，不再是甘草饲喂量与杯状细胞的体积变化及IgA分泌量呈正比。这方面可以做更进一步的研究。■（编辑：赵晓松）

［1］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（二部）［M］.北京：化学工业出版社.2000：65～66.

［2］胡金锋，叶仲林，沈凤嘉.云南甘草化学成分的研究（Ⅰ）［J］.天然产物研究与开发1994，04：6～8.

［3］金宏.浅谈甘草药理作用［J］.时珍国医国药，2000，11（1）78～79.

［4］陈少峰，余胜民等.甘草止咳祛痰作用研究［J］.时珍国医国药，2009，20（11）：173～177.

Effects of Licorice additives on numbers of goblet cells and IgA secretion of sheep bronchial mucosa

Zhang Haiyan
（Sanhe animal husbandry and Fisheries Bureau，Sanhe Hebei，065200）

By exploring the main pharmacological effects of licorice and the main component of medicinal value and efficacy，to study Licorice additive effects on the immune function of the respiratory system in sheep.

Licorice additives；Bronchial mucosa；Goblet cell；IgA