仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产工艺关键技术研究

郑铁鑫，张影，邢育钢，柴华，尹尧（哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）

仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产工艺关键技术研究

郑铁鑫，张影，邢育钢，柴华，尹尧
（哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）

仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产过程中，存在培养菌数低，冻干死亡率高等问题，影响产品的产量。本文针对仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产工艺关键技术进行研究，通过筛选接种量、培养基配方与通气量的参数关系；优化发酵培养工艺，采用自动添加40%葡萄糖补充碳源并作为调节pH值的手段；使用分光光度法与冻干工艺结合作为收获标准，从而达到提高培养菌数，降低冻干死亡率。本研究为生产高效、安全、稳定的仔猪副伤寒活疫苗产品提供有力地技术支持。

仔猪副伤寒活疫苗；生产工艺；菌数

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.003

仔猪副伤寒活疫苗由中国兽医药品监察所的房晓文等选用抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株在含有醋酸铊的普通肉汤中传代培养，经传数百代后，筛选出一株毒力弱而免疫原性良好的弱毒菌株，命名为猪霍乱沙门氏杆菌C500弱毒株，于1965年开始试用，1976年被批准列入兽医生物制品规程，已在全国许多生物制品厂生产，用C500弱毒菌株制成仔猪副伤寒活疫苗，经田间试验和区域试验证明疫苗安全有效，该疫苗在我国大范围推广使用，使我国仔猪副伤寒得到了有效控制，取得了可观的经济效益和社会效益［1］。

我公司生产的仔猪副伤寒活疫苗从固体培养，到现在的微生物发酵罐通气培养，生产量不断增大，生产工艺趋于稳定，现在随着技术的提高，我公司经过不断创新，通过对培养基配方以及相应培养条件的优化改进，使产品由原来的平均27头份/瓶增加到43头份/瓶。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1生产用种子猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500，由中国兽医药品监察所提供。

1.1.2效检攻毒菌株猪霍乱沙门氏菌C78-2强毒株，由中国兽药监察所提供。

1.1.3培养基普通琼脂、普通肉汤、40%葡萄糖溶液、酪胨琼脂斜面（G.A）、硫乙醇酸盐酪胨汤（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P），均由本公司培养基班组提供。

1.1.4实验动物大耳白家兔，由本公司动物实验室提供。

1.2设备

1.1.1上海高机生物工程公司 BIOF-6200B微生物发酵罐。

1.2.2日本岛津UV-2550分光光度计。

1.2.3上海彼爱姆光学仪器制造有限公司显微镜。

1.3方法

1.3.1生产用种子的制备按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（以下简称《规程》）的标准规定的方法和要求进行一级种子繁殖、鉴定和二级种子繁殖，二级种子平均菌数为19×108CFU/mL［2］，二级种子按培养量1%、2%、3%准备，检验纯粹后备用。

1.3.2普通肉汤按《规程》方法制造，pH值为7.6左右，121℃蒸汽灭菌40 min。

1.3.3半合成培养基将蛋白胨、牛肉膏、NaCl等按不同比例设计成3种配方，用蒸馏水溶解，用8%的NaOH溶液调整pH值为7.6左右，分装，121℃蒸汽灭菌40 min。

1.3.4培养接种后开始以100 r/min进行培养，过程中采用分段搅拌方式，自动调节由100 r/min增加至200 r/min；培养过程中通过采用自动添加40%葡萄糖进行调节pH值的方法，控制培养环境酸碱度在pH7.4左右，使整个培养过程达到自动化精准控制。

1.3.5培养条件的优化筛选将种子液（A变量因素）按培养基量的1%、2%、3%接种至对应3种半合成培养基（C变量因素）中，37.5℃，通气量（B变量因素）采用固定12 m3/h；固定20 m3/h；从12 m3/h逐渐加到20 m3/h三种方式。

1.3.6培养终点的选择从1.3.5项计数结果中选择合适的一组，其它培养条件不变，分别对设定收获时间进行取样，利用分光光度法检测样品在600 nm处的吸收值，并对样品进行菌数测定，针对各个样品进行分装冻干，检测冻干后菌数情况。

1.3.7发酵罐批次生产验证从1.3.5项计数结果选择合适的一组搭配，从1.3.6项选择合适的培养时间，培养温度37.5℃，搅拌速度100～200 r/min，罐压0.05 MPa，进行发酵罐大量生产试验。分别于培养结束和冷冻真空干燥后取样计数，计算冻干存活率［3］，并按《规程》方法进行安全性检验。

2　结果

2.1培养的优化改进

2.1.1通过L9（33）正交试验A1B1C1400亿/mL、A1B2C2395亿 /mL、A1B3C3360亿 /mL、A2B1C2380亿 /mL、A2B2C3380亿/mL、A2B3C1410亿/mL、A3B1C3385亿/mL、A3B2C1445亿/mL、A3B3C2375亿/mL，极差分析结果可以看出，三个参数效果是RC＞RA＞RB，同时也可以看出A3B2C1达到445亿/mL为较优组合（见表1）。

表1　选用L9（33）正交试验表前三项进行现场实验，计算培养菌数

2.1.2通过分光光度法检测培养18 h样品的吸收值趋于最高，18～21 h期间吸收值只有小幅增长；培养至19 h，培养菌数最高，而培养18 h的冻干死亡率最低，综合考虑冻干前菌数，冻干后菌数，冻干死亡率以及分光光度法值几项参数，培养至18 h为最佳培养时间（见表2）。

表2　各时间点的吸收值（600nm）、冻干前菌数（108CFU/mL）、冻干后菌数（108CFU/mL）

2.2发酵罐应用试验结果

根据极差分析法与分光光度法，优化结果进行发酵罐应用试验，三个批次试验结果表明，采用改进后方法仔猪副伤寒活疫苗培养菌数平均达到543×108CFU·mL-1，冻干存活率可达到74%（见表3），与以往生产结果相比培养菌数增高，冻干存活率较稳定，安全性好［3］。

表3　改进前后发酵罐培养结果比较

3　小结与讨论

1）根据试验结果，综合考虑冻前培养菌数和冻干存活率两项因素，在采用发酵罐进行培养的条件下，确定了仔猪副伤寒活疫苗生产工艺中的一些关键性技术参数。

2）参数自动化设定调节方式，降低批间次差异，使工艺更加稳定。

3）采用极差分析方法，更加科学的选择试验参数方案；引入分光光度法，对培养终点的选择提供理论数据。

4）分光光度法在试验中的成功引入，对此种方法的科学性提供理论基础，将此种方法应用于其它产品的试验中提供科学依据。■（编辑：赵晓松）

［1］杨红云，伊鸿，康兴，等.仔猪副伤寒C500活疫苗纯粹检验中可疑菌落的鉴定［J］.中国兽药杂志，1999，33（1）：30-32.

［2］杨红云，康兴，张小萍，等.仔猪副伤寒活疫苗生产工艺的改进［J］.中国兽药杂志，2002，36（6）：49～50.

［3］中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇一〇年版［S］.

Study on Key Technologies of the Production Process for Piglet Paratyphoid Live Vaccine（C500 Strain）

Zheng Tiexin，Zhang Ying，Xing Yugang，Chai Hua，Yin Yao
（Harbin Pharmaceutical Group Bio-vaccine Co.，Ltd，Harbin Heilongjiang，150069）

Low cultured bacterial and lyophilized high mortality and other problems exist in the piglet paratyphoid live vaccine（C500 strain）production process，affecting the yield of the product.In this paper，the key technologies of manufacturing process for piglet paratyphoid live vaccine（C500 strain）were studied to solve these problems by screening parameters related to inoculation amount and media formulations and ventilation volume，optimizing the fermentation process，adding 40%glucose automatically as carbon source and a means of adjusting the pH value and combining spectrophotometric method and freeze-drying process as the product harvest standards.This study provides strong technical support to produce highly efficient，safe and stable piglet paratyphoid live vaccine products.

piglet paratyphoid live vaccine，manufacturing process，bacterial count

郑铁鑫（1982-），男，籍贯山东，理学学士，兽医师，从事兽用生物制品生产。