GFP标记 IX蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

邹小辉 郭小娟 王敏 屈建国 鲁茁壮 洪涛

100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

·技术方法·

GFP标记 IX蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

邹小辉 郭小娟 王敏 屈建国 鲁茁壮 洪涛

100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

目的 为了更加直观地观察腺病毒（Adenovirus，Ad）与细胞之间的相互作用，本研究拟构建一株经绿色荧光蛋白（Green F1uorescent Protein，GFP）标记（pIX）蛋白的5型重组腺病毒（Ad5-IXGFP）。方法 我们将GFP基因构建至腺病毒穿梭质粒pShutt1e中IX基因3'端，通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内的同源重组，获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXGFP。将pAd5-IXGFP质粒经Pac I酶切线性化后转染293细胞，拯救出重组腺病毒Ad5-IXGFP。结果 经扩增和超速离心纯化后可获得浓度为6.9×1011vp/m1的重组腺病毒。该病毒于4℃与HEp-2细胞孵育后，重组病毒吸附于HEp-2细胞表面，用荧光显微镜观察，可见绿色荧光。结论 利用反向遗传学技术对重组腺病毒外壳蛋白pIX进行修饰，成功制备的经GFP标记的重组腺病毒可用于实时动态追踪腺病毒颗粒感染细胞的过程。

【主题词】 腺病毒；衣壳蛋白IX；绿色荧光蛋白；荧光标记

Fund program：Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（31400156）

腺病毒（Adenovirus，Ad）是直径为约90 nm的正二十面体无包膜病毒，其主要衣壳蛋白包括五邻体、六邻体及纤维蛋白；次要衣壳蛋白包括VI，VIII，IX，IIIa蛋白［1］。人5型腺病毒（Ad5）感染细胞的过程中，五邻体的Fiber介导病毒吸附到细胞表面，同时五邻体基上的 RGD基序（Arginine-G1ycine-Aspartate peptide）识别细胞表面的αVβ3，αVβ5次受体。病毒由受体介导的内吞作用进入细胞后，病毒颗粒从胞内体释放到细胞浆中，并在动力蛋白的驱动下沿着微管运输到微管组织中心或者细胞核外表面，在核孔复合物释放IX蛋白与六邻体蛋白，同时Adv基因组DNA进入细胞核进行复制及转录，IX蛋白与六邻体蛋白几乎是最后从病毒衣壳上脱落的蛋白组分［2］。

表1　PCR扩增用引物Tab.1 Primers used for PCR

在腺病毒科的4个属中，病毒IX基因只存在于哺乳动物腺病毒属［3］，在其余的禽类腺病毒属、富AT腺病毒属和唾液酸酶腺病毒属三个属中并没有发现其同源序列。另外，pIX还具有转录因子活性，对腺病毒的E1A、E4、晚期启动子和某些宿主细胞的基因表达具有调控作用［4］；最近的研究表胆外壳蛋白pIX与kinesin的轻链结合，介导逃离内吞体后腺病毒向核周的运输［5］。但pIX是否与腺病毒基因组一同进入细胞核目前还不清楚（进入细胞核的pIX有可能发挥转录因子活性）。这里我们试图构建GFP标记pIX的重组5型腺病毒，为研究腺病毒进入细胞后pIX的亚细胞定位打下基础。

1 材料与方法

1.1材料 质粒pSh5-GFP、293细胞、HEp-2细胞，病毒Ad5-GFP为本室保存［6］，Adeasy系统（包括pShutt1e质粒、pAdeasy-1质粒和E.coli BJ5183感受态细胞）购自美国 Stratagene公司，转染试剂Lipofectamine 2000为美国Life Techno1ogies公司产品，限制性内切酶Bgl II、BstX I、Pme I、Pac I为美国NEB公司产品，胎牛血清（FBS）为美国Hyc1one公司产品。PCR引物为使用Primer Premier5软件设计，序列信息见表1，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2载体构建 以质粒pShutt1e为模板，以1406 IXSOGF1与1504A5IXG-R1为引物，扩增556 bp的片段；以 pSh5GFP为模板，以 1504A5IXG-F2与1504A5IXG-R2为引物，扩增 782 bp的片段；以pShutt1e为模板，以1504A5IXG-F3与1406SOGR3为引物，扩增619 bp片段。上述3条片段混合作为模板，以1406IXSOGF1与1406IXSOGR3为引物，扩增含有HAdV-5病毒结构蛋白IX的部分基因与完整GFP基因的1 878 bp片段，该片段经Bgl II与BstX I双酶切，然后与经同样双酶切的pShutt1e载体连接，得到IX编码区3'端融合GFP基因的pSh5-IXGFP质粒。经测序正确的pSh5-IXGFP质粒经Pme I双酶切进行线性化，电泳回收后与pAdeasy-1质粒在E.coliBJ5183内重组，得到 pAd5-IXGFP腺病毒质粒。

1.3Ad5-IXGFP病毒拯救 经 PacI线性化的pAd5-IXGFP DNA用Lipofectamine 2000转染293细胞，转染6 h后更换为含2%FBS的DMEM细胞培养基，继续培养，用荧光显微镜观察有绿色荧光聚集现象，或者用普通倒置显微镜观察有噬斑时，将培养瓶移至 -80℃冰箱，冻融3次后，12000 g离心3 min，回收上清作为第1代种子病毒，于-80℃冻存。

1.4重组腺病毒Ad5-IXGFP的扩增与纯化 将种子病毒Ad5-IXGFP接种293细胞，吸附6～8 h后更换含2%FBS的DMEM培养基，继续培养至细胞出现完全细胞病变（cytopathic effec，CPE）后，按1.3方法收取第2代种子病毒。病毒经过4次传代后，将最终获得的病毒上清用氯化铯密度梯度离心进行纯化，经消化法测定滴度［6］，于-80℃冻存。

1.5重组腺病毒Ad5-IXGFP的鉴定 纯化病毒再次感染293细胞，48 h后经Hirt法提取病毒基因组，以 1509IXGFP-F与 1509IXGFP-R为引物或1207GFP-F与1207GFP-R为引物，PCR方法验证Ad5-IXGFP病毒基因组（图1）中IX与GFP基因融合情况，反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸110 s，25个循环；72℃延伸5 min。

图1　腺病毒Ad5-IXGFP与Ad5-GFP基因组示意图Fig.1 Schematic representation of the genomes of Ad5-IXGFP and Ad5-GFP

1.6荧光显微镜观察Ad5-IXGFP病毒在细胞表面的吸附 使用胰酶消化对数生长的HEp-2细胞并计数，在含1%FBS DMEM培养基中以20 000 MOI（感染复数，vp/ce11）吸附 Ad5-GFP或 Ad5-IXGFP病毒。在冰水浴条件下，病毒吸附5 h后（每1-2 h振摇1次），在病毒-细胞混合液中直接加入10倍体积的含1%甲醛的PBS溶液，室温固定30 min，300 g离心5 min，弃大部分上清，保留少许上清重悬细胞，荧光显微镜下观察细胞表面吸附病毒的情况。

2 结果

2.1重组腺病毒Ad5-IXGFP病毒的拯救 pAd5-IXGFP经Pac I酶切线性化并经乙醇沉淀回收后转染293细胞，在荧光显微镜下观察，48 h后可见较少绿色荧光，11 d后荧光细胞数量增多，局部区域形成荧光灶，但并未见噬斑形成。将收获的第1代种子病毒感染新鲜293细胞，感染后3 d可见细胞出现较多荧光聚集现象，表明重组Ad5-IXGFP病毒拯救成功并能够在293细胞中增殖。

2.2Ad5-IXGFP病毒的纯化与鉴定 将拯救成功的Ad5-IXGFP病毒继续感染293细胞，传代4次扩增至5个细胞培养皿（直径150 mm），收获病毒并进行CsC1密度梯度离心纯化，得到纯化病毒约1.0 m1，消化法测得其滴度为6.9×1011vp/m1。采用PCR法对Ad5-IXGFP病毒基因组中IX-GFP基因的融合情况进行鉴定。以1207GFP-F和1207GFP-R为引物时，Ad5-IXGFP与Ad5-GFP病毒基因组中均能扩增出404 bp的目的片段，表明2种病毒均含有GFP基因。分别在IX序列与GFP序列中设计上下游引物，经PCR对Ad5-IXGFP病毒基因组扩增，结果显示，扩增产物与预期的1 188 bp大小相符；而以Ad5-GFP病毒基因组作为模板时并未见扩增产物，表明Ad5-IXGFP病毒基因组中GFP融合于IX基因3'端（图2）。

IX-G：以1509IXGFP-F和1509IXGFP-R为引物；GFP：以1207GFP-F和1207GFP-R为引物；5-IX：以Ad5-IXGFP病毒基因组DNA为模板；5-G：以Ad5-GFP病毒基因组DNA为模板；M：DL2000 DNA Marker图2　Ad5-IXGFP重组腺病毒基因组的鉴定IX-G：primers of 1509IXGFP-F and 1509IXGFP-R，GFP：primers of 1207GFP-F and 1207GFP-R.5-IX：genomic DNA of Ad5-IXGFP，5-G：genomic DNA of Ad5-GFP.M：DL2000 DNA MarkerFig.2 Identification of the genome of recombinant Ad5-IXGFP with PCR

2.3Ad5-IXGFP病毒对细胞的吸附 将 Ad5-IXGFP病毒与HEp-2细胞于4℃孵育5 h后，可以在荧光显微镜下看到HEp-2细胞周围出现较强荧光（图3），而经Ad5-GFP处理的HEp-2细胞及未经病毒感染的HEp-2细胞却未见荧光。表明本研究构建的Ad5-IXGFP病毒吸附到细胞表面后，IX蛋白携带的GFP能够被荧光显微镜解析。

3 讨论

本研究利用重叠延伸PCR，在AdEasy腺病毒载体系统的pShutt1e质粒右臂pIX基因下游插入GFP编码框，使得获得的重组病毒表达pIX-GFP融合蛋白（GFP位于融合蛋白C端），由于pIX的N端是插入病毒颗粒外壳的部位，而C端游离于病毒颗粒外表面，表达的pIX-GFP融合蛋白能够组装到病毒颗粒外壳，从而使得重组病毒带有GFP标签。HEp-2病毒吸附实验证明重组病毒能够吸附到靶细胞，并且病毒颗粒自身携带有GFP标签，说明我们成功构建了GFP标记的重组腺病毒。

Ad5-GFP或Ad5-IXGFP病毒分别以20 000 MOI（感染复数，vp/ce11）与HEp-2细胞于4℃孵育5 h后，经1%甲醛的PBS溶液，室温固定30 min后荧光显微镜下观察细胞表面吸附病毒的情况。图3　荧光显微镜观察Ad5-IXGFP病毒对HEp-2细胞的吸附HEp-2 ce11s were dispersed into suspended sing1e ce11s after trypsin treatment and were incubated with Ad5-IXGFP or Ad5-GFP at a mu1tip1icity of infection（MOI）of 20 000 for 5 h at 4℃，respective1y.The ce11s were then fixed with 1% forma1dehyde and visua1ized under f1uorescence microscope.Fig.3 Visua1ization of the attachment of Ad5-IXGFP on the surface of HEp-2 ce11s under f1uorescence microscope

pIX是一个含有140个氨基酸残基的多肽，表达于病毒复制的中期，pIX基因具有独立的启动子，是唯一不受主要晚期启动子（MLP）调控的结构蛋白。pIX具有转录因子活性，在病毒复制过程中参与调控病毒和细胞基因表达。作为结构蛋白，pIX锚定六邻体结构，起到稳定病毒粒子的作用；在病毒进入细胞、逃离内吞体后，pIX参与病毒粒子的细胞浆运输，在将病毒基因组转运到细胞核的过程中发挥重要作用［5］。但pIX是否与病毒基因组一同进入细胞核，目前还不完全清楚［4，7］。我们构建了 GFP标记pIX的重组病毒，为进一步研究病毒进入细胞后pIX的亚细胞定位打下了基础。

［1］ Russe11 WC.Adenoviruses：update on structure and function.J Gen Viro1，2009，90（Pt 1）：1-20.doi：10.1099/vir. 0.003087-0.

［2］ Greber UF，Suoma1ainen M，Stidwi11 RP，Boucke K，Eberso1d MW，He1enius A.The ro1e of the nuc1ear pore comp1ex in adenovirus DNA entry.EMBO J，1997，16：5998-6007.doi 10.1093/emboj/16.19.5998.

［3］ Parks RJ.Adenovirus protein IX：a new 1ook at an o1d protein. Mo1 Ther，2005，11：19-25.doi：10.1016/j.ymthe.2004. 09.018.

［4］ Rosa-Ca1atravaM，GraveL，Puvion-Duti11eu1F，eta1. Functiona1 ana1ysis of adenovirus protein IX identifies domains invo1ved in capsid stabi1ity，transcriptiona1 activity，and nuc1ear reorganization.J Viro1，2001，75：7131-71341.

［5］ Strunze S，Enge1ke MF，Wang IH，et a1.Kinesin-1-mediated capsid disassemb1y and disruption of the nuc1ear pore comp1ex promote virus infection.Ce11 Host Microbe，2011，10：210-223. doi：10.1016/j.chom.2011.08.010.

［6］ Lu ZZ，Zou XH，Dong LX，et a1.Nove1 recombinant adenovirus type 41 vector and its bio1ogica1 properties.J Gene Med，2009，11：128-138.doi：10.1002/jgm.1284.

［7］ Le LP，Everts M，Dmitriev IP，et a1.F1uorescent1y 1abe1ed adenovirus with pIX-EGFP for vector detection.Mo1 Imaging，2004，3：105-116.

Construction and identification of recombinant adenovirus with GFP labeled protein I
X

ZouXiaohui，Guo Xiaojuan，Wang Min，Qu Jianguo，Lu Zhuozhuang，Hong Tao National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China

Lu Zhuozhuang，Email：luzz@ivdc.chinacdc.cn

Objective To study the ro1e of protein IX（pIX）in the interaction between adenovirus and host ce11 dynamica11y，we attempt to construct a recombinant human adenovirus with the capsid protein pIX being 1abe11ed with Green F1uorescent Protein（GFP）.Methods GFP gene was inserted into the downstream of pIX genein the shutt1e p1asmid to form pShutt1e-IXGFP；and adenovira1 p1asmid pAd5-IXGFP was generated by homo1ogous recombination of pShutt1e-IXGFP with the backbone p1asmid（pAdeasy-1）in E.coli BJ5183 strain.Recombinant adenovirus（Ad5-IXGFP）was rescued by transfecting 293 ce11s with the 1inearized pAd5-IXGFP.Results After 4 rounds of propagation in 293 ce11s，viruses were purified with CsC1 u1tracentrifugation method.Ad5-IXGFP in 1.0 m1 with a partic1e titer of 6.9×1011vp/m1 was fina11y obtained.PCR was performed to confirm the fusion of IX with GFP gene in the genome of Ad5-IXGFP. Virions were incubated with suspended HEp-2 ce11s at 4℃ for 5 h，and the attachment of Ad5-IXGFP on the ce11u1ar membrane cou1d be observedunderf1uorescencemicroscope.ConclusionGFP-1abe11ed recombinant adenovirus was successfu11y constructed，which cou1d be a va1uab1e too1 for subce11u1ar 1oca1ization fo pIX after virus entry rea1-time sing1e adenovirus tracking by confoca1 f1uorescence microscopy.

Adenovirus；capsid protein IX；GFP；f1uorescent 1abe1ing

国家自然科学基金（31400156）

鲁茁壮，Emai1：1uzz@ivdc.chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.023

2015-12-01）