肠道病毒性脑炎的患儿T细胞活化亚群和细胞因子的变化

方春艳 邹小杰 袁哲峰 黄明海 高峰

310000杭州，浙江大学医学院附属儿童医院［方春艳（研究生在读）、袁哲峰、高峰］；313000湖州，浙江省湖州市中心医院（邹小杰）；315000宁波市妇女儿童医院（方春艳、黄明海）

肠道病毒性脑炎的患儿T细胞活化亚群和细胞因子的变化

方春艳 邹小杰 袁哲峰 黄明海 高峰

310000杭州，浙江大学医学院附属儿童医院［方春艳（研究生在读）、袁哲峰、高峰］；
313000湖州，浙江省湖州市中心医院（邹小杰）；315000宁波市妇女儿童医院（方春艳、黄明海）

目的 通过对肠道病毒性脑炎（Enterovirus Encepha1itis，EVE）的患儿T细胞活化亚群、细胞因子的检测，探讨其在EVE发病机制中的可能作用。方法 选择2014年6月至2015年7月浙江大学医学院附属儿童医院神经科病房收住院的24例脑脊液肠道病毒阳性的EVE患儿为病例组，其中14例予活化T细胞亚群检测，24例均予细胞因子流式测定，同期门诊体检的49例健康儿童为对照组。通过流式细胞术检测两组外周血CD25+/CD3+CD4+、CD69+/CD3+CD4+、HLA-DR/ CD3+CD4+、CD25+/CD3+CD8+、CD69+/CD3+CD8+、HLA-DR/CD3+CD8+，及IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ水平。结果 病例组外周血CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+的表达含量（1.193%±2.849%，0.696% ±1.242%）低于对照组（Z=-2.722，P=0.006；Z=-3.321，P= 0.001）。外周血病例组 IL-2的表达水平（3.342±1.089 pg/m1）低于对照组（Z=-2.722，P= 0.019）；而IL-6，TNF-α的表达水平（123.046±355.349；3.367±1.717 pg/m1），与对照组相比，有所增加，差异有统计学意义（Z=-3.471，P=0.001；Z=-4.803，P＜0.001）。结论 EVE患儿存在一定程度的免疫功能紊乱，T细胞活化亚群和细胞因子可能参与了EVE的发病过程。

【主题词】 肠道病毒性脑炎；脑脊液肠道病毒DNA阳性；T-淋巴细胞；细胞因子类

肠道病毒性脑炎（Enterovirus Encepha1itis，EVE），是小儿中枢神经系统感染常见病、多发病。近年来，肠道病毒性脑炎成为我国病毒性脑炎的第一位病原［1，2］。EVE是肠道病毒感染所致。其临床表现复杂多样、涉及人体各个系统。肠道病毒引起的疾病大部分表现是温和的，包括上呼吸道感染、手口足病、皮疹、有发热、乏力等［3，4］。但EVE的发病机制尚不清楚，可能与免疫相关［5］。本研究对EVE患儿进行外周血T细胞活化亚群及细胞因子的检测，以探讨其在EVE发病中的意义。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2014年6月至2015年7月浙江大学医学院附属儿童医院神经科病房收住院的24例脑脊液肠道病毒阳性EVE患儿为病例组，其中14例予活化T细胞亚群检测，24例均予细胞因子流式测定，所有病例临床均符合以下诊断标准［6-8］。具体是首先排除其他病原体所引起的脑膜炎：1）脑脊液肠道病毒DNA阳性，同时咽拭子、粪便等标本检测肠道通用病毒核酸阳性者；2）在一病程中，同时出现呕吐症状及头痛伴发热（≥37.5℃）的15岁以下儿童；3）脑电图或脑脊液检测具备病毒性脑炎表现者。同期门诊体检的49例健康儿童为对照组，男性23例，女性26例，年龄0.6岁至15.16岁。正常对照组与EVE患儿组年龄和性别无统计学差异（P＞0.05）。标本收集均经过患者家属知情同意，本研究经浙江大学医学院伦理委员会审查通过。

1.2研究方法

1.2.1仪器：FACS Ca1ibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2.2试剂：细胞因子试剂盒Ⅱ（BDTMCBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II，BD Biosciences，应用于流式细胞微球芯片捕获技术人检测T辅助细胞1/2）。购自美国BD公司的荧光抗体CD25-FITC/CD4-PE/ HLA-DR-APC/CD69PerCP、CD25-FITC/CD8-PE/ HLA-DR-APC/CD69PerCP、磷酸盐缓冲液 （PBS 0.01mo1/L，pH7.4）和溶血素（FACS1M）。

1.2.3 标本采集：两组入院后24 h内采集外周血2.9 m1，分2管，各为0.9 m1、2 m1，分别行T细胞活化亚群、细胞因子检测。

1.2.4T细胞活化亚群检测：分别取肝素抗凝的外周血0.3 m1加入3管Fa1con管中，然后分别加入荧光抗体CD25-FITC/CD4-PE/HLA-DR-APC/CD69Per CP、CD25-FITC/CD8-PE/HLA-DR-APC/CD69PerCP，对照管中加入对应的同型对照，4℃避光孵育30 min，然后每管分别加入2 m1溶血素，室温避光孵育20 min，离心弃上清，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次后，加入PBS 0.3 m1悬浮细胞，然后用流式细胞仪FACS Ca1ibur（美国BD公司）进行检测，收集20 000个细胞，使用Ce11 Quest软件分析数据。

1.2.5细胞因子检测：取2 m1外周血，2 h水浴（37℃）后，分离血清。上述试剂置于室温1 h，混合TNF-a、INF-r、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10捕获微球，5 min 200 g离心，弃上清。加入同体积血清样本增强缓冲液，微球重悬避光反应30 min，然后每FACS管加入50 μ1藻红蛋白（PE）荧光抗体，50 μ1标准品和待检血清，50 μ1混合捕获微球，混匀。室温3 h避光孵育，每管加洗液1 m1，5 min 200 g离心，每管加洗液300 μ1，流式细胞检测在3 h内进行。数据获取后，标准曲线自动绘制（使用CBA软件），样本中各细胞因子含量根据标准曲线计算获得。细胞因子的检测的范围为上限5000.0 pg/m1和下限1.0 pg/m1。

1.2.6脑脊液肠道病毒DNA检测方法：上海之江生物科技股份有限公司的肠道病毒通用型、EV71型、CA16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法），仪器为ABI 7500型荧光定量PCR仪，检测方法按试剂盒说明书操作。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计分析。首先通过K-S检验，对资料进行分布特征分析，如为非正态性分布数据，则采用Mann-Whitney U检验；如为正态性分布数据，则采用独立样本的t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组患儿外周血T细胞活化亚群的表达含量

14例EVE患儿外周血中 CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+的表达含量分别为（1.193± 2.849）%，（0.696±1.242）%与对照组（2.595± 4.134）%，（2.422±2.697）%相比，有所降低，差异有统计学意义（Z=-2.722，P=0.006；Z= -3.321，P=0.001）。而外周血 CD25+/CD3+ CD4+、CD25+/CD3+CD8+、HLA-DR+/CD3+ CD4+、HLA-DR+/CD3+CD8+的表达含量与正常对照组比较，无统计学意义（均P＞0.05）（表1）。

表1　肠道病毒性脑炎患儿与正常对照儿童T细胞活化亚群表达（%，±s）Tab.1 The 1eve1s of CD25+/CD3+CD4+，HLA-DR/CD3+CD4+，CD69+/CD3+CD4，CD25+/CD3+CD8+，HLA-DR/CD3+CD8+，+CD69+/CD3+CD8+，expression in periphera1 b1ood（%，±s）

表1　肠道病毒性脑炎患儿与正常对照儿童T细胞活化亚群表达（%，±s）Tab.1 The 1eve1s of CD25+/CD3+CD4+，HLA-DR/CD3+CD4+，CD69+/CD3+CD4，CD25+/CD3+CD8+，HLA-DR/CD3+CD8+，+CD69+/CD3+CD8+，expression in periphera1 b1ood（%，±s）

组别Group例数n CD25+ /CD4+CD3+ HLA-DR+ /CD3+CD4+ CD69+ /CD3+CD4 CD25+ /CD3+CD8+ HLA-DR+ /CD3+CD8+ CD69+ /CD3+CD8+ EVE　14　7.256±5.362　7.256±9.367　1.193±2.849　0.886±0.969　17.983±12.634　0.696±1.242正常对照组Contro1 group　43　9.863±5.230　6.645±3.574　2.595±4.134　1.463±1.405　22.028±12.543　2.422±2.697 t/Z　t=1.355　Z=-1.242　Z=-2.722　Z=-1.451　t=0.5147　Z=-3.321 P 0.1827　0.214　0.006　0.147　0.6077　0.001

表2　肠道病毒性脑炎患儿与正常对照儿童细胞因子的表达水平（pg/m1，±s）Tab.2 The 1eve1s of IL-2，IL-4，IL-6、IL-10，TNF-α，INF-γexpression in periphera1 b1ood（pg/m1，±s）

表2　肠道病毒性脑炎患儿与正常对照儿童细胞因子的表达水平（pg/m1，±s）Tab.2 The 1eve1s of IL-2，IL-4，IL-6、IL-10，TNF-α，INF-γexpression in periphera1 b1ood（pg/m1，±s）

组别Group　例数n　IL-2　IL-4　IL-6　IL-10　TNF-α　INF-γ EVE　24　3.342±1.089　3.05±0.79455 123.046±355.349 6.383±7.883　3.367±1.717　9.338±9.058正常对照组Contro1 group　49　4.114±1.292　3.108±0.855　12.412±28.988　4.398±2.621　2.039±0.746　6.292±3.438 t/Z　Z=-2.722　Z=-0.429　Z=-3.471　Z=-0.523　Z=-4.803　Z=-1.480 P 0.019　0.668　0.001　0.601　0.000　0.139

2.2两组患儿外周血细胞因子的表达水平 24例EVE患儿外周血中，病例组IL-2的表达水平（3.342 ±1.089 pg/m1）低于对照组，有统计学意义（Z= -2.722，P=0.019）；而 IL-6，TNF-α的表达水平（123.046±355.349；3.367±1.717pg/m1），与对照组相比，有所增加，差异有统计学意义（Z= -3.471，P=0.001；Z=-4.803，P＜0.001）。外周血IL-4、IL-10和INF-γ的表达水平与正常对照组比较，均无统计学意义（均P＞0.05）（表2）。

3 讨论

肠道病毒是引起急性神经系统感染一种较常见的病原［9］，通过唾液、粪便污染的物品而密切接触传播，所以特别容易在幼儿园或者小学的儿童中流行爆发。近来由于肠道病毒引起的小儿病毒性脑炎表现多样而复杂，缺乏特异性的症状与体征，病因学诊断困难，所以常有漏诊、误诊［9］，其发病机制目前尚未完全阐明，已有研究阐述免疫因素对发病有一定的作用［5］。本研究就EVE外周血T细胞活化亚群、细胞因子表达异常进一步阐明其急性期存在免疫功能紊乱。

CD69又称活化诱导分子（activation inducer mo1ecu1e，AIM），早期活化抗原一1（ear1y activation antigen一1，EA-1），有研究表明，CD69表达量的显著增高，表明了T细胞活性的增强［10］。因此，被认为是T细胞活化的早期标志。本研究发现病例组外周血CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+的表达含量低于对照组，提示EVE存在T细胞早期活化受到抑制，有所减少。而CD25+/CD3+CD4+、CD25+/CD3+CD8+、HLA-DR+/CD3+CD4+、HLA-DR+/CD3+CD8+与对照组相比差异无统计学意义，未提示T细胞早期活化受到抑制，考虑可能与病程有关。

IL-2在调节感染的免疫应答和免疫病理的过程中起着非常重要的作用［11，12］。IL-2的功能的正常发挥最终能够增强免疫系统的活性，抑制病毒感染或其它相关病理变化。但是如果IL-2的产生或表达异常，则会导致疾病的发生。在本研究中，检测病例组外周血细胞因子发现IL-2的表达水平明显低于对照组，提示肠道病毒性脑炎患者的免疫功能低下，主要表现在Th细胞分泌IL-2的能力减少，从而反映了T细胞免疫功能的低下与紊乱。另外IL-2能够刺激NK细胞产生INF-γ，增强细胞毒效应，而其表达的减少可能抑制INF-γ的水平。在本研究中，EVE患者与正常对照组相比较，INF-γ的表达水平没有显著统计学意义上的差异，其原因有待进一步探讨。

TNF-α有两个主要的作用，一是它可引起宿主严重的病理损害如损伤、发热、休克等，主要是因为其可作为病菌感染时重要的炎症递质；二是它能够防御病原微生物的侵入，主要通过调节机体免疫功能［11，12］。在本研究中，TNF-α的表达水平，EVE患者与正常对照组相比，明显增加。TNF-α是由Th1分泌的促炎因子，外周血中检测其表达的升高，提示在疾病的发展过程中，其分泌可能升高。病毒激活的炎症级联反应中，TNF-α是最先激活的细胞因子，它又能够诱导IL-6的产生，因此，在本研究中亦发现EVE患者的IL-6的表达水平明显升高。IL-2的表达减少，以及IL-6、TNF-α过度分泌，破坏了平衡状态，从而导致机体免疫调控网络功能紊乱，加重了免疫病理损伤。这些结果表明 IL-2、IL-6以及TNF-α在EVE的发生和发展中可能有重要作用。

本研究显示EVE患儿急性期外周血 CD69/ CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+，IL-2的表达含量降低，IL-6、TNF-α表达水平升高，提示T细胞活化亚群和细胞因子可能参与了EVE的发病过程，并使机体出现一定程度的免疫功能紊乱，引起免疫损伤，导致相应的临床症状。因此，细胞因子IL-2、IL-6和TNF-α，以及T细胞亚群CD69/CD3+CD4+、CD69/ CD3+CD8+的表达水平可以作为诊断肠道病毒性脑炎辅助指标。对于是否需在肠道病毒性脑炎病程急性期进行一定的免疫调节干预尚有待进一步的临床研究。

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The T cell activation and cell factor's changes in enterovirus encephalitis children

Fang Chunyan，Zou Xiaojie，Yuan Zhefeng，Huang Minghai，Gao Feng The Children's Hospital Affiliated Medical school of Zhejiang University，Hangzhou，310000，China（Fang CY，Yuan ZF，Gao F）；Huzhou Central Hospital，Huzhou，313000，China（Zou XJ）；Ningbo Women& Children's Hospital，Ningbo，315000，China（Fang CY，Huang MH）

Gao Feng，Email：peakgf@126.com

Objective To exp1ore the action of immune function in Enterovirus Encepha1itis（EVE）chi1dren by detecting the T ce11 activation and ce11 factors.Methods 24 infant patients with EVE hospita1ized in the wards of department of neuro1ogy of the Chi1dren's Hospita1 Affi1iated to Medica1 Schoo1 of Zhejiang University from June 2014 to Ju1y 2015 were se1ected as the experimenta1 group，14 of the 24 patients were detected for the T ce11 activation.Whi1e another 49 hea1thy infants accepting physica1 check in the same period were se1ected as the contro1 group.F1ow cytometry was adopted to detect the periphera1 b1ood CD25+/CD3+CD4+，CD69+/CD3+CD4+，HLA-DR+/CD3+CD4+，CD25+/CD3+CD8+，CD69+/CD3+CD8+，HLA-DR+/CD3+CD8+，and IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ 1eve1s of the two groups.Results The periphera1 b1ood CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+ expression 1eve1s（1.193%±2.849%，0.696% ±1.242%）of the experiment group were 1ower than those of the contro1 group（Z=-2.722，P=0.006；Z=-3.321，P=0.001）.The expression 1eve1 of the periphera1 b1ood IL-2（3.342±1.089 pg/m1）was 1ower than that of the contro1 group（Z=-2.722，P= 0.019）；whi1e the expression of IL-6 and TNF-α（123.046±355.349；3.367±1.717pg/m1）were significant1y higher than the contro1 group（Z=-3.471，P=0.001；Z=-4.803，P＜0.001）。Conclusion There is certain degree of immune dysfunction in EVE patients，T ce11 activation subgroup and the ce11 factors may participate in the morbidity progress of EVE.

Enterovirus Encepha1itis；CSF enterovirus DNA positive；T ce11 activation subgroup；Ce11 factor

高峰，Emai1：peakgf@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.015

2016-01-31）