2012-2013年广州市5起胃肠炎暴发中诺如病毒的分子流行病学特征

谢华萍 耿进妹 刘静雯 陈纯 蔡文锋 狄飚 袁俊

510440广州市疾病预防控制中心

2012-2013年广州市5起胃肠炎暴发中诺如病毒的分子流行病学特征

谢华萍 耿进妹 刘静雯 陈纯 蔡文锋 狄飚 袁俊

510440广州市疾病预防控制中心

目的 了解2012年12月至2013年1月期间我国广州5起胃肠炎暴发诺如病毒的分子流行病学特征。方法 收集2012年12月至2013年1月广州市5起胃肠炎暴发（A-E）共274份粪便标本和流行病学资料，利用RT-PCR方法对诺如病毒进行检测，对扩增产物进行序列测定。用C1usta1 X 1.83和MEGA 5.05生物软件对诺如病毒序列进行序列比对和系统进化分析。用SPSS17.0软件进行统计分析。结果 诺如病毒的总阳性率为20.07%（55/274），其中，A高校诺如病毒阳性率为8.70%（2/23）、B幼儿园为36.36%（8/22）、C高校为36.07%（22/61）、D社区卫生中心为100% （5/5）、E高校为11.04%（18/163），60岁及以上年龄组诺如病毒阳性率为100%（6/6），10-19岁年龄组为47.37%（9/19），9岁及以下年龄组为36.36%（8/22）。系统进化分析表明33份成功分型的阳性标本均为诺如病毒GⅡ.4型新变异株Sydney 2012感染。结论 诺如病毒是引起广州市急性胃肠炎暴发的主要病原之一，GⅡ.4型新变异株Sydney 2012是当年流行的优势毒株。

【主题词】 诺如病毒；急性胃肠炎；暴发；Sydney 2012变异株

【Key words】Norovirus；Acute gastroenteritis；Outbreak；Sydney 2012 variant

Fund programs：Key Medicine Discip1ine Construction of Guangzhou Municipa1ity（2013-2015-07）；Guangzhou Medica1 and Hea1th Science and Techno1ogy Project（20151A011057）

人诺如病毒属于杯状病毒科，是导致世界范围内胃肠炎暴发的主要病原，尤其是在医院、学校、监狱、养老院等相对封闭的环境。其流行在全世界范围内造成了较高的发病率、病死率以及严重的经济负担［1］，尤以儿童、老年人、免疫抑制人群和免疫缺陷人群为主［2］。

诺如病毒是单链正股RNA病毒，基因组长度约7.5～7.7 kb，5′末端为一帽状结构，3′末端为多聚A尾。根据其VP1区或RdRp区核苷酸序列的不同，诺如病毒可被分为至少6个基因组（genogroup，GIGVI），其中，GI、GⅡ、GⅣ可感染人，以GI和GⅡ组诺如病毒最为常见［3］。诺如病毒的核苷酸序列有着较大的差异，不同基因组包含许多不同的基因型，不同基因型又有许多变异株。目前至少有32种人诺如病毒基因型被确定，其中GⅡ.4型是全世界范围内广泛流行的主要基因型，人急性胃肠炎中有55%～85%为GⅡ.4型诺如病毒所致。自1995年以来，GⅡ.4型诺如病毒已在全球引起了许多次急性胃肠炎的暴发流行，每次均是不同的GⅡ.4型变异株所致［4］：1995-2000年为 95/96US变异株，2002-2004年为Farmington Hi11s 2002变异株，2004-2005年为Hunter 2004变异株，2006-2010年为Den Haag 2006b变异株，2009-2012年为 New Or1eans 2009变异株，2012年一种新的 GⅡ.4变异株Sydney 2012开始流行，先后在澳大利亚、美国等国家地区引起了急性胃肠炎的暴发流行［5］。

Sydney2012毒株最早于2012年3月在澳大利亚首次发现［6］，此后在澳大利亚和新西兰［5］、亚洲地区［7］、欧洲地区［8］、加拿大［9］、美国［10］等国家和地区迅速播散，并取代了之前的优势毒株 New Or1eans 2009，引起全球急性胃肠炎暴发的增加。2012年底至2013年初，我国广州地区发生了5起急性胃肠炎的暴发，为了解这5起暴发是否由诺如病毒Sydney 2012所致，本研究进行了相关的检测及分析。

1 材料与方法

1.1标本收集及处理 2012年12月至2013年1月，本研究收集了高校（A、C、E）、幼儿园（B）、越秀区某卫生服务中心（D）共5起胃肠炎暴发共274份粪便标本，标本贮存于-20℃冰箱。取100 μ1粪便上清（固体取小豌豆大小），加入900 μ1标本处理液，漩涡震荡混匀，室温静置10 min后，8000 rpm离心5 min，将得到的便悬液置于-20℃保存。

1.2核酸提取及PCR扩增 采用QIAamp Vira1 RNA提取试剂盒（德国 Qiagen公司）进行核酸提取，具体操作严格按照说明书进行。用 Jiang等［11］的方法检测诺如病毒和札如病毒，所用引物名称、扩增区域、引物序列、扩增片段大小、反应体系的配制和反应条件的设定参见文献。

1.3克隆及测序 PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳验证，对出现目的条带的阳性产物，采用Qiagen公司胶回收试剂盒进行切胶回收，连接于Promega公司的克隆载体 pGEM-T easy，然后转化E.coli DH5α（天根），用Omega公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取，经EcoRⅠ（Takara）单酶切鉴定后，送至上海生物工程科技有限公司测序。

1.4数据分析 在Genebank网站下载诺如病毒相关参考株序列，应用C1usta1 X软件（1.83）进行序列的多重比对和分析；应用MEGA5.05软件（http：// www.megasoftware.net/）构建系统进化树。最后利用SPSS17.0软件进行相关的统计分析。

2 结果

2.1流行病学特征 根据RT-PCR结果，本研究274份粪便样本中共有55份为诺如病毒感染，总阳性率为20.07%。2012年12月10日至12月19日期间，共有2起急性胃肠炎暴发，总阳性率为48.15 （13/27）；2013年1月10日至1月29日期间，共有3起暴发，总阳性率为17.00%（42/247）。

如图1所示：5起暴发中，A高校诺如病毒阳性率为8.70%（2/23）；B幼儿园诺如病毒阳性率为36.36%（8/22）；C高校诺如病毒阳性率为36.07% （22/61）；D社区卫生服务中心诺如病毒阳性率为100%（5/5）；E高校诺如病毒阳性率为11.04% （18/163），其中10名病例包括学生、教师和校医，诺如病毒核酸阳性率为47.6%（10/21）；另外8名阳性来自于该校某餐厅无症状厨工，阳性率为29.6%（8/27）。

所有55份诺如病毒阳性病例中，男性共36例，阳性率为26.67%（36/135）；女性共19例，阳性率为13.67%（19/139）；不同性别之间诺如病毒阳性率的差异有统计学意义（χ2=7.211，P=0.007）。不同年龄段中，以60岁及以上年龄组阳性率最高为100%（6/6）；其次为10～19岁年龄组，阳性率为47.37%（9/19）；9岁及以下年龄组阳性率为36.36%（8/22）；不同年龄组诺如病毒阳性例数及阳性率详见图2。

2.2基因型别分析

图1　不同暴发区域诺如病毒阳性率分布Fig.1 Distribution of positive detection rate of norovirus in different outbreak areas

图2　不同年龄组诺如病毒检出率分布Fig.2 Distribution of detection rate of norovirus in different age groups

本研究完成测序并成功分型的诺如病毒阳性标本共33份，经系统发育分析显示：所有成功分型的标本均为GⅡ.P4型Sydney 2012变异株感染。详见图3。

3 讨论

大量的研究资料显示，诺如病毒是引起急性胃肠炎散发的重要病原，更是引起暴发的最常见病原。由于诺如病毒变异速度快，传染性较高，其感染剂量又低，加以传播途径多样，使得其能在学校、养老院、监狱、游轮等相对封闭的环境空间内迅速传播；诺如病毒感染在全球范围内已造成了严重的经济负担［1］，人们对诺如病毒愈来愈加关注。因此，对急性胃肠炎暴发进行相关流行病学调查和病原监测，对于流行株的变化、新变异株的流行及急性胃肠炎的防控有着重要的意义。众所周知，在5岁以下儿童胃肠炎散发病例中，诺如病毒是仅次于轮状病毒的病原，但在急性胃肠炎暴发病例中，诺如病毒更为常见。2012年12月至2013年1月，广州市发生了5起急性胃肠炎的暴发，经本研究检测分析发现，诺如病毒在这5起暴发中均有检出；其中，D社区卫生服务中心的胃肠炎暴发均为诺如病毒GII.4新变异株Sydney 2012所致，B幼儿园诺如病毒阳性率为36.36%（8/22），C高校为36.07%。这些数据表明，广州市5起胃肠炎暴发中，诺如病毒是引起暴发的主要病原之一。诺如病毒全年皆有流行，其活动度在不同季节皆可有所波动，以冬季为主［10］，而本研究中2012-2013年广州市的5起暴发均发生在冬季，这为诺如病毒的活动度在寒冷季节增加提供了佐证。诺如病毒所致感染，以儿童、老年人、免疫低下人群为多，亦以这几类人群症状为重；本研究5起胃肠炎暴发的所有病例中，以60岁及以上年龄组阳性率最高为100%（6/6）；其次为10-19岁年龄组，阳性率为47.37%（9/19）；9岁及以下年龄组阳性率为36.36%（8/22）；这些结果与国内外的研究报道相符合［1，12］。

有研究显示，在2009-2010年美国的食源性诺如病毒暴发中，有53%的暴发的污染源来自被病毒感染的厨工［13］。在本研究中，对发生在E高校的急性胃肠炎暴发进行调查显示，18例阳性标本分别来自10名病例和8名该校某餐厅的厨工，阳性率分别为47.6%（10/21）和29.6%（8/27）。在对该餐厅进行全面消毒清洗，将携带病毒的厨工调离工作岗位后，病例数逐渐减少。因此，推断该起疫情的暴发原因可能是携带病毒的厨工在制作食品的过程中直接或间接污染食物而导致。

诺如病毒变异率极高，与甲型流感病毒相似，每隔2-3年便有新的变异株出现［14］，由于人类对新的变异株缺乏足够的群体免疫力，使得新变异株极易引起急性胃肠炎的暴发。2005-2006年，国内外均先后出现了诺如病毒GⅡ.4变异株2006b的流行，此后诺如病毒GⅡ.4型2006b变异株一直是引起全球急性胃肠炎暴发的主要病原；直到2009年，美国等部分地区出现了GⅡ.4型Or1eans 2009变异株，逐渐取代了2006b的优势地位［4］；中国虽也有Or1eans 2009变异株的流行，但其并未取代2006b的优势地位［15］。2012年3月以来，澳大利亚等地区先后出现了Sydney 2012变异株的流行，并取代了之前的流行株成为新的优势毒株［5］；本研究中，所有成功分型的诺如病毒均为GⅡ.4型新变异株Sydney 2012，并无GⅡ.4型变异株2006b或者Or1eans 2009检出，这说明广州地区诺如病毒所致暴发中，GⅡ.4型新变异株Sydney 2012已成为优势毒株，这与国内外的研究报道相一致［16］。

图3　诺如病毒聚合酶区系统进化树Fig.3 Phy1ogenetic tree of sequence of RNA po1ymerase region among norovirus in Guangzhou

总而言之，诺如病毒是导致急性胃肠炎暴发的主要病原之一，目前GⅡ.4型变异株Sydney 2012在中国已取代2006b的优势地位。因此，普及诺如病毒胃肠炎的认识，提高省市疾控诺如病毒常规监测及检测能力；同时，完善卫生管理制度及食品加工流程，加强对食品、水卫生的管理，严格监控厨工等从业人员的健康状况，对于诺如病毒相关胃肠炎的防控有着重要的意义。

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Molecular epidemiology of Norovirus from acute gastroenteritis outbreaks in Guangzhou

XieHuaping，Geng Jinmei，Liu Jingwen，Chen Chun，Cai Wenfeng，Di Biao，Yuan Jun Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510440，China

Xie Huaping，Email：paopaobox@163.com

Objective To understand the mo1ecu1ar epidemio1ogy of norovirus from 5 outbreaks of gastroenteritis during Dec.2012 to Jan.2013 in Guangzhou.Methods Epidemio1ogic data and specimens were co11ected from 5 gastroenteritis outbreaks in Guangzhou.274 specimens were detected for norovirus by RT-PCR methods and PCR products were sequenced.Sequence a1ignment and phy1ogenetic ana1ysis were performed by using C1usta1 X 1.83 and MEGA 5.05 programs.Statistica1 ana1ysis was performed by using SPSS 17.0 program.Results The tota1 positive rate of norovirus was 20.07%（55/274）.The positive rate was 8.70% （2/23）in University A，36.36% （8/22）in Kindergarten B，36.07% （22/61）in University C，100% （5/5）in community hea1th service center D，11.04% （18/163）in University E.The positive rate was 100% （6/6）among age group≥60 years o1d，47.37% （9/19）among 10-19 age group and 36.36% （8/22）among age group＜10 years o1d.Phy1ogenetic ana1ysis showed that 33 samp1es were infected by the new variant-Sydney 2012 of norovirus GII.4.Conclusion Norovirus was one of the main pathogens causing acute gastroenteritis outbreaks and GII.4 Sydney 2012 variant was identified as the predominant strain in Guangzhou.

广州市医学重点学科建设项目（2013-2015-07）；广州市医药卫生科技项目（20151A011057）

谢华萍，Emai1：paopaobox@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.014

2016-02-23）