中枢神经系统感染和脓毒症患儿人副肠孤病毒和非脊髓灰质炎肠道病毒感染的特征

吴迪 宋秦伟 张又 钱渊 丁雅馨 赵林清 邓洁 王芳 孙宇 朱汝南

100020北京，首都儿科研究所病毒研究室儿童病毒病病原学北京市重点实验室

中枢神经系统感染和脓毒症患儿人副肠孤病毒和非脊髓灰质炎肠道病毒感染的特征

吴迪 宋秦伟 张又 钱渊 丁雅馨 赵林清 邓洁 王芳 孙宇 朱汝南

100020北京，首都儿科研究所病毒研究室儿童病毒病病原学北京市重点实验室

目的 通过检测患儿脑脊液和血清标本中的HPeV和NPEV，结合临床探讨其在儿童中的感染特征。方法 收集2014年1月至12月首都儿科研究所附属儿童医院来自600例16岁以下怀疑中枢神经系统感染或脓毒症患儿的脑脊液标本543份和血清标本173份，其中116例患儿同时收集到脑脊液和血清标本。通过实时荧光RT-PCR和巢式RT-PCR的方法对HPeV和NPEV进行筛查及分型。结果 在最终诊断为CNS感染的136例患儿中，HPeV阳性率为1.5%，NPEV阳性率为16.9%；诊断为脓毒症的51例患儿中，HPeV阳性率为5.9%，NPEV阳性率为3.9%；其他诊断的413例患儿中，HPeV阳性率为3.4%，NPEV阳性率为2.9%。HPeV感染患儿以0月～＜3月年龄组最多，而NPEV则以3岁～＜7岁组最多。NPEV感染的高峰为7月～9月，而HPeV感染的高峰为11月和12月。结论 HPeV感染患儿年龄低于NPEV感染患儿，HPeV和NPEV可在儿童中引起脓毒症或CNS感染等严重疾病。

【主题词】 人副肠孤病毒；非脊髓灰质炎肠道病毒；中枢神经系统感染；脓毒症；儿童

Fund programs：Beijing Municipa1 Hea1th Bureau“Advanced Personne1 Training Program”（2013-3-087）；Beijing Municipa1 Science&Techno1ogy Commission（Z111107056811041）

人副肠孤病毒（Human parechovirus，HPeV）和肠道病毒（enteroviruses，EV）同属小RNA病毒科。血清学研究表明，1岁以内的儿童体内抗HPeV抗体阳性率最低［1］，因此低龄儿童成为HPeV感染的主要对象。HPeV感染后主要引起胃肠道和呼吸道症状，但也可引起中枢神经系统（centra1 nervous system，CNS）感染［2］以及脓毒症等较严重的疾病［3］。EV型别繁多，其感染同样可引起诸如脑炎、脑膜炎、偏瘫、心肌炎、呼吸系统疾病、消化系统疾病和出疹性疾病等。鼻病毒虽被划分为EV属范畴，但是其主要造成呼吸系统感染［4］；脊髓灰质炎病毒虽属于EV属，但在全球范围内已被基本根除［5］，因此本研究只对非脊髓灰质炎肠道病毒（non-po1io enteroviruses，NPEV）进行分析。

HPeV与NPEV虽在儿童中广泛流行，其感染常被临床所忽略。因此，本研究通过对首都儿科研究所附属儿童医院（北京）就诊的怀疑病毒所致的中枢神经系统感染或脓毒症患儿的脑脊液和血液标本进行HPeV和NPEV筛查，以了解HPeV和NPEV在儿童中枢神经系统感染和脓毒症中的作用，并分析其感染特征，以期为临床的诊治及预防监控提供依据。

1 方法与材料

1.1标本及临床资料的来源 收集2014年1月1日至2014年12月31日，在首都儿科研究所附属儿童医院就诊且怀疑为病毒感染引起的中枢神经系统感染或脓毒症患儿，并送至本实验室进行单纯疱疹病毒（herpes simp1ex virus，HSV）常规筛查的脑脊液标本和/或血清标本，对HSV检测为阴性的标本进行HPeV和NPEV病毒的平行筛查。共收集到来自600例患儿的543份脑脊液标本和173例份血清标本。其中，136例患儿最终诊断为CNS感染，51例患儿诊断为脓毒症，413例患儿诊断为其他疾病。136例CNS感染患儿中有128例采集到脑脊液标本，43例采集到血清标本，其中35例同时采集到脑脊液和血清标本。51例脓毒症患儿中有42例采集到脑脊液标本，19例采集到血清标本，其中10例同时采集到脑脊液和血清标本。其他诊断的413例患儿中，373例采集到脑脊液标本，111例采集到血清标本，其中71例同时采集到脑脊液和血清标本。所有标本均保存于-40℃。临床资料通过查阅住院患儿的病例获得。本研究项目通过了首都儿科研究所伦理委员会的批准。

1.2核酸提取及cDNA合成 脑脊液及血清无特殊处理，使用QIAamp Vira1 RNA Mini Kit（Qiagen公司，德国）提取核酸。核酸保存于-80℃备用。使用随机引物进行反转录合成cDNA，保存于-20℃。

1.3HPeV筛查及分型 采用针对HPeV 5'非编码区中基因保守区域的引物对脑脊液和血清标本进行筛查，并采用基于基因变异显著的衣壳蛋白基因（VP）3和1交界区的引物对筛查为阳性的标本进行分型［6］。将阳性扩增产物进行序列测定。

1.4EV筛查及分型 采用本实验室参考文献所设计的引物［7］和针对EV5'非编码区中基因保守区域设计的引物，对脑脊液和血清标本进行 EV的筛查。

1.5统计学方法 测序得到的序列在GenBank中进行B1ast序列比对。采用SPSS20.0对资料进行统计学分析。采用χ2检验进行计数资料组间比较。

以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1HPeV和NPEV的检测结果 从不同类型标本中HPeV和NPEV的筛查结果分析，543份脑脊液标本仅检测出1份HPeV阳性，阳性率为0.2%，未能收集到该患儿血清标本；32份NPEV阳性标本，阳性率为5.9%，其中10例患儿收集到血清标本，但NPEV结果为阴性。在173份血清标本中共检测出18份HPeV阳性标本，阳性率为10.4%，其中10例收集到脑脊液标本，但 HPeV均为阴性；5例NPEV阳性标本，阳性率为2.9%，其中4例患儿收集到脑脊液标本，但NPEV均为阴性。经对HPeV 和NPEV筛查为阳性的标本进行分型PCR扩增、测序和序列比对，进行进一步分型，结果见表1。

2.2不同临床诊断病例中HPeV和NPEV的检测

结果 在最终诊断为CNS感染的136例患儿中，有2例为HPeV阳性，占1.5%；23例为NPEV阳性，占16.9%。在诊断为脓毒症的51例患儿中，3例为HPeV阳性，占5.9%；2例为NPEV阳性，占3.9%。其他诊断的413例患儿中，14例为HPeV阳性，占3.4%；12例为NPEV阳性，占2.9%。HPeV主要检出于血清标本，而NPEV则主要检出于脑脊液标本。

2.3HPeV和NPEV感染患儿的年龄和季节分布

在年龄分布上，NPEV阳性的患儿相对年长于HPeV阳性的患儿（P＜0.001）。HPeV阳性患儿以0～＜3个月组，占63.2%（12/19）；而NPEV阳性患儿则以3～＜7岁年龄组最多，占48.6%（18/37）。全年均可检出NPEV，主要集中在7-9月，而HPeV的检出主要集中在11月和12月。

表1　HPeV和NPEV阳性标本分型及病例诊断Tab.1 Types and diagnosis of human parechovirus（HPeV）and non-po1io enteroviruses（NPEV）

2.4HPeV和NPEV患儿的临床特征及影像学改变 通过对HPeV或NPEV阳性患儿病历资料的查阅，综合分析感染HPeV和NPEV患儿的临床表现特征、相关实验室检查数据以及影像学资料（表2）。结果显示，HPeV和NPEV感染后常见症状为发热，部分患儿可出现抽搐和颈抵抗等神经系统阳性症状。脑脊液的实验室检查结果显示，NPEV感染后患儿的脑脊液白细胞数高于HPeV感染后患儿（P =0.006），但脑脊液生化改变无显著差异。9例HPeV阳性患儿进行了神经影像学检查（CT/MRI），其中5例出现病理性改变。30例NPEV阳性患儿进行了神经影像学检查，其中10例出现了病理性改变。

3 讨论

NPEV和HPeV在全球范围内广泛流行［8，9］，但目前我国对于HPeV的研究仍然十分有限，因此对HPeV和NPEV的长期监测是十分必要的。

表2　HPeV和NPEV患儿的临床特征、实验室检查及影像学改变Tab.2 C1inica1 characteristics，imaging and 1aboratory profi1es of human parechovirus infection（HPeV）andnon-po1io enteroviruses（NPEV）

本研究对2014年本研究室所收集的怀疑CNS感染或脓毒症患儿的543份脑脊液标本和173份血清标本进行了HPeV以及NPEV的筛查与分型，并结合临床特征进行了综合分析。本研究中NPEV感染患儿的年龄大于HPeV感染患儿，且感染患儿的年龄范围更广泛，与Han等人［10］的研究结果显示一致。国内外大部分的研究显示［11］，NPEV感染主要在夏秋季节高发，HPeV-1高发于秋冬季节，HPeV-3型高发于夏季。在本研究中NPEV感染主要在7-9月，与其他研究结果相一致。而本研究中成功分型的HPeV-1和未能成功分型的HPeV在11月和12月检出最多。本研究HPeV分型成功率较低，可能是病毒载量过低、分型方法本身的局限性所造成，但也不排除是病毒突变或新型别的产生所造成。

在病毒性CNS感染中NPEV是最常见的病原体，而CV-B5、E-6、E9、E30为最常见的型别［12］。本研究中NPEV在CNS感染患儿中阳性率最高，其中以CV-B5和E-6所占比例最高，进一步证实B组NPEV与 CNS感染关联紧密；在脓毒症患儿中，HPeV阳性率高于NPEV，这与文献报道HPeV是脓毒症患儿中最为常见的病毒病原一致。HPeV主要检出于血清标本，而NPEV则主要检出于脑脊液标本，因此，同时对脑脊液和血清进行HPeV和NPEV的检测有利于提高病原的检出率，也提示NPEV更容易侵入CNS而造成CNS感染，而HPeV感染后所造成的疾病谱较广。

发热是感染NPEV和HPeV后的最常见症状，除此以外神经系统症状如抽搐、颈抵抗、巴氏征、布氏征也可出现。在Harva1a等的研究中［13］，绝大多数感染NPEV或HPeV的患儿未出现神经系统影像学改变，而在本研究中约三分之一感染NPEV和/或HPeV患儿经神经影像学检查出现了神经系统感染性改变。在本研究中有部分HPeV或NPEV阳性的患儿出院诊断为头痛和抽搐，这些患儿虽未诊断为CNS感染，但随着病程的发展，也并不能排除最终造成CNS感染的可能性。

目前，HPeV和NPEV的感染尚未在临床引起足够重视，且新生儿以及儿童的CNS感染缺乏特异性，易造成漏诊。因此，在临床医疗中应对HPeV和NPEV感染引起足够的重视，及时对怀疑CNS感染或脓毒症患儿的脑脊液和/或血清标本进行HPeV 和NPEV筛查，尽早确定病原，以便及时采取有效的治疗措施。

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Characteristics of human parechovirus and non-polio enteroviruses infections in children suspected central nervous system infections or sepsis in 2014 of Beijing

Wu Di，Song Qinwei，Zhang You，QianYuan，Ding Yaxin，Zhao Linqing，Deng Jie，Wang Fang，Sun Yu，Zhu Runan Laboratory of Virology，Capital Institute of Pediatrics，Beijing Key Laboratory of Etiology of Viral Diseases in Children，Beijing 100020，China

Zhu Runan，Email：runanzhu@163.com

Objective To better understand the characteristics of HPeV and NPEV infections by detecting HPeV and NPEV in cerebrospina1 f1uids（CSF）and b1ood samp1es.Methods A tota1 of 543 CSF and 173 b1ood samp1es were co11ected from 600 chi1dren younger than 16 years o1d who were suspected as vira1 CNS infection or sepsis from January to December in 2014 in Beijing，in which CSF and b1ood samp1es were co11ected simu1taneous1y from 116 chi1dren.Rea1-time RT-PCR and transcription-nested PCR（RT-nPCR）were performed to detect HPeV and NPEV.Results HPeV and NPEV were detected in 1.5%and 16.9%in 136 chi1dren diagnosed as CNS infectious diseases，5.9%and 3.9%in 51 chi1dren diagnosed as sepsis，and 3.4%and 2.9%in 413 chi1dren with other diagnosis.HPeVs were main1y detected in chi1dren under 3 months of age，whi1e NPEVs were frequent1y detected in chi1dren aged 3～＜7 years.The majority of NPEV infections occurred in the period from Ju1y to September，whi1e most of HPeV infections happened in November and December.Conclusions The data indicated that chi1dren with HPeV infections were younger than those with NPEV infections and that both HPeV and NPEV may cause CNS infections and sepsis in chi1dren.

Human parechovirus；Non-po1io enteroviruses；Centra1 nervous system infections；Sepsis；Chi1dren

北京市卫生系统高层次卫生技术人员培养计划（2013-3-078）；北京市科技计划（Z111107056811041）

朱汝南，Emai1：runanzhu@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.011

2015-12-29）