陕西省汉滩病毒分离株全基因组序列分析及生物学特性研究

马颖欣 余鹏博 张全福 李建东 王世文 李德新

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（马颖欣、张全福、李建东、王世文、李德新）；陕西省疾病预防控制中心（余鹏博）马颖欣、余鹏博并列第一作者

陕西省汉滩病毒分离株全基因组序列分析及生物学特性研究

马颖欣 余鹏博 张全福 李建东 王世文 李德新

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（马颖欣、张全福、李建东、王世文、李德新）；陕西省疾病预防控制中心（余鹏博）
马颖欣、余鹏博并列第一作者

目的 从肾综合征出血热（HFRS）患者外周血单个核细胞（periphera1 b1ood 1eukocytes，PBMC）中分离汉坦病毒，并对分离株全基因组序列测定及进化分析。方法 采集急性期HFRS患者外周血，分离PBMC后与Vero-E6细胞混合培养分离汉坦病毒，通过Rea1-time PCR和IFA法检测，扩增分离株全基因组片段进行序列测定及分析，并采用SX26分离株样本与HFRS患者恢复期血清和免疫接种者血清各50份进行微量中和试验。结果 成功分离到两株汉滩型毒株并获得全基因组序列，进化分析显示与西安分离株XAAa10091712同源性较高；微量中和试验结果显示50份HFRS患者恢复期血清分别中和分离株SX26与疫苗株Z10，中和抗体滴度差异有统计学意义，另50份免疫接种者血清样本针对SX26和Z10毒株产生的中和抗体阳转率分别为72%及88%，差异有统计学意义。结论 通过PBMC分离汉坦病毒可作为病毒分离的另一种途径；流行株与Z10疫苗株的抗原性存在差别，疫苗株产生的抗体中和流行株效果较弱，提示病毒进化过程中已发生部分变异，为疫苗免疫效果研究和肾综合征出血热的防治工作提供依据。

【主题词】 汉坦病毒；病毒分离；外周血单个核细胞；全基因组测序；进化分析；微量中和试验

Fund programs：Nationa1 Science and Techno1ogy Major Project of China“Infectious disease 1aboratory monitoring of core techno1ogy and techno1ogy system research”（2012ZX10004215）；Nationa1 Science and Techno1ogy Infrastructure Program“The techno1ogy research for the prevention and contro1 of ka1a azar，ma1aria，vira1 hemorrhagic fever”（2014BAI13B05）

汉坦病毒（Hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，为有包膜分节段的单股负链RNA病毒，主要引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with rena1 syndrome，HFRS）［1，2］。目前HV分离难度较大，多数研究以鼠肺途径分离为主，而人源分离株的相关报道较少，且主要来自于HFRS患者外周血或血浆。据文献报道［3，4］，HFRS发病机制与外周血单个核细胞（periphera1 b1ood 1eukocytes，PBMC）密切相关，有研究证明可从患者PBMC中分离出PUUV型汉坦病毒［5］，我国学者也曾用该方法分离到汉坦病毒［3］。因此本研究尝试从PBMC中分离汉坦病毒，并通过序列分析研究陕西省西安地区汉坦病毒流行毒株情况，为验证PBMC途径分离方法以及进一步研究宿主源与人源分离株的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1病毒、抗体、细胞 汉滩病毒84FLi株、汉城病毒L99株以及抗核蛋白抗体L13F3均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热室提供；非洲绿猴肾上皮（Vero-E6）细胞购自美国细胞培养中心（ATCC）；细胞培养基MEM及胎牛血清（FBS）购自美国Invitrogen公司。

1.2样本采集及外周血单个核细胞（PBMC）分离

于2014年11月—2015年1月，在陕西省西安市八院采集急性发热期HFRS患者外周血38份，恢复期患者血清样本29份，胶体金方法（厦门波生生物技术公司）检测IgM、IgG抗体后进行PBMC分离；另恢复期患者血清样本31份，汉坦病毒疫苗免疫接种者血清50份由陕西省疾病预防控制中心提供。PBMC分离方法如下，抗凝血8 m1与等量Hank's液混匀后缓缓覆盖到 16 m1淋巴细胞分离液（HisTOPAQUE-1077，Sigma）上，400 g水平离心30 min；吸出白色PBMC层，无菌PBS溶液洗一遍后用完全培养基重悬备用。

1.3汉坦病毒分离 取上述PBMC与Vero-E6细胞用MEM细胞维持液（含2%FBS）1∶1混合培养（37℃，5%CO2），每4～6 d换液，21 d后进行次代盲传，每代细胞上清液进行Rea1-time PCR检测，细胞制备抗原片进行间接免疫荧光检测，三代均为阴性的样本视为未分离出病毒。

1.4Real-time PCR及间接免疫荧光（IFA）检测

根据RNA提取试剂盒说明书（RNeasy Mini Kit，Qiagen），提取待测样本RNA作为Rea1-time PCR检测模板，采用一步法荧光定量 RT-PCR试剂盒（AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit，ABI）按说明书配制25 μ1双重反应体系，其中HTNV型和SEOV型引物及探针均由本科室提供。反应条件为50℃30 min，95℃15 s，60℃45 s，共40个循环进行荧光检测。取核酸阳性样本制备抗原片，抗核蛋白鼠单抗L13F3（1∶100稀释）为一抗，FITC标记的抗鼠IgG抗体（Sigma）作为二抗，选择汉滩病毒84FLi株感染的Vero-E6细胞和正常Vero-E6细胞制备的抗原片作为阳性对照和阴性对照，紫外荧光显微镜下观察拍照。

1.5空斑纯化试验 将Vero-E6细胞传至6孔板并长满单层，病毒分离株进行10倍梯度稀释，接种于细胞表面，1.5 h后加入第一层琼脂糖固体培养基；7 d后加入第二层含3.3%中性红溶液（Sigma）的琼脂糖固体培养基，出斑后用毛细吸管挑取形状规则的独立斑，传至单层Vero-E6细胞的6孔板中，重复上述实验连续挑斑三代进行病毒纯化。

1.6分离株全基因组序列测定及进化分析 以分离株病毒RNA为模板，根据逆转录试剂盒说明书（Transcriptor High Fide1ity cDNA Synthesis Kit，Roche公司）合成cDNA，并以此为模板，扩增全基因组片段（FastStart High Fide1ity PCR System，Roche），1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增片段测序由北京天一辉远公司完成。用DNASTAR软件分析病毒全基因组序列，与GeneBank数据库中汉坦病毒序列比对，通过MEGA 6.0软件构建进化树并进行同源性分析。

1.7微量中和试验 将采集的恢复期和疫苗免疫血清56℃水浴30 min灭活，在96孔细胞培养板中，从1∶10开始进行2倍梯度稀释，50 μ1稀释血清与等体积的病毒稀释液（100TCID50）混合，4℃中和过夜后加入100 μ1 Vero-E6细胞悬液（105个细胞/ m1），每稀释度设4个复孔，7 d培养后弃上清，细胞用丙酮固定后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的L13F3抗体检测，比较同一份血清样本对不同毒株的中和抗体滴度区别。

2 结果

2.1样本信息及IgM、IgG抗体检测 外周血样本共计38例，均采自发病3～6 d，其中男性31例、女性7例，男性多于女性，最高体温平均38.8℃，IgM抗体阳性率91.4%，IgG抗体阳性率42.8%，其中IgM（+）且IgG（-）19例，占50%。

2.2荧光定量PCR及IFA检测 38份样本的PBMC经荧光定量RT-PCR检测，结果显示仅一例阳性，盲传三代后有2例样本的IFA结果显示阳性（图1），图中可见特异性针尖样绿色荧光灶，且荧光定量PCR显示为HTNV型汉坦病毒，即证明分离得到两株汉滩型病毒，分别命名为SX26和SX27。

2.3空斑纯化试验 SX26和SX27病毒分离株感染Vero-E6细胞后，均于第7天左右出现空斑（图2），空斑呈大小不等的类圆形，直径约为0.5～1.0 mm，计算每孔出斑数量，获得空斑滴度分别为2× 106和2×105PFU/m1。

图1　间接免疫荧光法检测分离株汉坦病毒抗原Fig.1 Ana1ysis of antigen of HV iso1ates by immunof1uorescence assay

2.4SX26、SX27序列系统进化及同源性分析BLAST检索相关毒株序列，并用 MEGA 6.0和DNASTAR软件包中的MegA1ign软件进行比对及构建进化树（图3）。结果显示两分离株S片段在进化树上高度同源，核苷酸相似性为97.3%，与西安分离株XAAa10091712同源性较高，与汉滩病毒标准株76-118、疫苗构成株Z10和汉城型毒株同源性较低，核苷酸相似性分别为96.9% ～98.4%、86% ～87%、89%和73%左右；L片段与S片段结果类似，与西安分离株XAAa10091712同源性较高，分别为98.6%和95.6%；而与汉滩病毒代表株同源性均在85.0%以下；M片段与天津分离株TJJ16同源性最高，为98.4% ～96.2%，与汉滩病毒代表毒株76-118及疫苗株Z10的同源性均在84%左右，与汉坦病毒其他型别毒株同源性低于80%。S、M及L三个片段的氨基酸同源性均约为95%～99%左右。

2.5微量中和试验

2.5.1患者恢复期血清中和抗体滴度分析：同一份恢复期血清样本针对SX26和Z10毒株的中和抗体滴度，呈现4倍及以上差别的共29例（图4）。实验数据不符合正态分布，采用SPSS 19.0统计软件，经配对秩和检验方法进行统计分析，P=0.001＜0.05，即差异有统计学意义，提示目前陕西省本地流行株与汉坦病毒疫苗株的抗原性存在一定差异。

图2　空斑纯化实验鉴定分离株汉坦病毒抗原Fig.2 Identification of HV iso1ates using p1aque forming test

图3　汉坦病毒部分S、M及L片段系统发生树Fig.3 Phy1ogenetic ana1ysis of partia1 S、M and L segment of Hantavirus

图4　患者恢复期血清中和抗体滴度分析Fig.4 The neutra1ization antibody titer of conva1escent serum samp1e

2.5.2疫苗免疫者血清中和抗体滴度分析：根据中国药品生物制品检定所相关研究［6］，确定中和抗体滴度≥1∶10为抗体阳转，则50份免疫接种者血清样本针对SX26及Z10毒株的抗体阳转率分别为72%及88%，经卡方检验分析（表1）显示P=0.046 ＜0.05，差异有统计学意义，提示疫苗接种后针对陕西分离株产生的抗体阳转率低于Z10毒株，推测目前所使用的汉坦病毒疫苗针对西安市流行毒株的免疫效果较弱。

3 讨论

我国HFRS发病率较高，以HTN和SEO型病毒感染为主［7］，陕西历年发病位居全国前列，2010-2012年出现明显的报告病例数上升，监测显示可能与啮齿动物带毒率较高相关［8］。近期研究报道该地区黑线姬鼠鼠肺中分离到汉滩型毒株［9］，而从患者中分离到汉坦病毒毒株报道较少。

表1　免疫接种者血清抗体阳转率比较Tab.1 The comparision of serum conversion rate of antibody after HFRS vaccine inocu1ation

根据以往病毒分离经验，由于HFRS患者体内病毒载量低，以及外周血中和抗体IgM和IgG阻碍病毒感染等原因，较难从外周血中分离到病毒，但外周血单个核细胞与汉坦病毒发病机制密切相关，研究显示其原因可能是PBMC结合的病毒能够避免与抗体结合［3］。Juto等［5］报道从PBMC中分离到汉坦病毒普马拉型（PUUV），我国学者杨为松等［3］研究也显示可通过此方法分离到汉坦病毒，且与血清分离法相比分离率较高。另有研究报道［10］通过RTPCR方法，检测到早期流行性出血热患者的PBMC中，HV核酸阳性率较高，这可能提示患者PBMC中出血热病毒有较高结合水平。因此，我们采集急性期HFRS患者外周血单个核细胞，尝试此方法进行病毒分离并成功获得两株汉滩型毒株。本研究初始阶段采用Rea1-time PCR方法对PBMC样本的核酸进行检测，阳性率均较低，与以往研究结果有一定差异，可能与检测方法的灵敏度以及PBMC中病毒载量有关，但经过三代盲传后病毒分离成功，揭示汉坦病毒确与出血热患者的PBMC有一定结合，但其主要免疫效应细胞群尚不清楚［4］。研究结果证实PBMC分离方法可作为汉坦病毒分离的另一种途径，且为进一步研究该地区汉坦病毒流行株提供依据。

研究获得两株汉坦病毒SX26和SX27全基因组序列，通过进化分析，与陕西省A16株病毒在同一分支，根据文献［11］，推断分离株S片段和M片段均属 H9亚型，与 2010年新发现西安分离株XAAa10091712同源性较高，提示属于同一亚型，符合汉坦病毒具有地区聚集性特点［12］，而与西安分离株84FLi和疫苗株Z10的核苷酸同源性较低，且M片段变异更大，而M片段编码包膜糖蛋白，存在汉坦病毒中和抗原位点，是病毒毒力的主要决定因素［13］，该变异可能造成本地流行株与疫苗株的抗原性差异，降低疫苗株刺激机体产生抗体的中和活性，与微量中和试验研究结果吻合。患者恢复期血清和疫苗免疫血清对中和流行毒株和疫苗株的差异有统计学意义，说明西安地区汉坦病毒流行株与Z10疫苗株的抗原性差别较大，且与疫苗株产生的中和抗体中和效果较弱，提示在进化过程中病毒已发生部分变异，但汉坦病毒疫苗的人群保护率还需进一步验证，这为改进研究疫苗免疫效果和肾综合征出血热的防治工作提供依据。

structure，expression and evo1ution.Gen Viro1，1996，77（Pt 11）：2677-2687.

［2］ P1yusnin A，Morzunov SP：Virus evo1ution and genetic diversity of hantaviruses and their rodent hosts.Curr Top Microbio1 and Immuno1ogy 2001，256：47-75.

［3］ 杨为松，白宪光，张文彬，等.从单核细胞中分离流行性出血热病毒.中华传染病杂志，1986，73：101-102.

［4］ Yao ZO，Yang WS，Zhang WB，et a1.The distribution and duration of hantaan virus in the body f1uids of patients with hemorrhagic fever with rena1 syndrome.J Infect Dis，1989，160：218-224.

［5］ Juto P，E1gh F，Ah1m C，et a1.The first human iso1ate of Puuma1avirusinScandinaviaascu1turedfrom phytohemagg1utinin stimu1ated 1eucocytes.J Med Viro1，1997，53：150-156.

［6］ 聂子林，俞永新.EHFV微量细胞病变中和试验方法的建立及其在中和抗体检测中的应用.中华微生物学和免疫学杂志，1991：263-265.

［7］ 周济华，张海林.汉坦病毒分型及致病性的研究进展.国际病毒学杂志，2008，25：37-42.doi：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2008.02.002

［8］ Ma C，Yu P，Nawaz M，et a1.Hantaviruses in rodents and humans，Xi′an，PR China.J Gen Viro1，2012，93：2227-2236. doi：10.1099/vir.0.043364-0.

［9］ 吴瑞，余鹏博，李静，等.汉坦病毒西安分离株基因组全序列测定及分析.陕西医学杂志，2013：1581-1582，1585.

［10］ 王卫华，段秋林，陈洁，等.外周血淋巴细胞中汉坦病毒基因检测对HFRS早期诊断的意义.现代实用医学，2002，14：521-523.doi：10.3969/j.issn.1671-0800.2002.10.005.

［11］ 王世文，杭长寿，王华，等.我国汉坦病毒基因型和基因亚型的分布研究.病毒学报，2002，18：211-216.doi：10.3321/ j.issn：1000-8721.2002.03.004.

［12］ Sibo1d C，Meise1 H，Kruger DH，et a1.Recombination in Tu1a hantavirus evo1ution：ana1ysis of genetic 1ineages from S1ovakia.J Viro1，1999，73：667-675.

［13］ Ogino M，Yoshimatsu K，Ebihara H，et a1.Ce11 fusion activities of Hantaan virus enve1ope g1ycoproteins.J Viro1，2004，78：10776-10782.

［1］ P1yusnin A，Vapa1ahti O，Vaheri A：Hantaviruses：genome

Complete genome sequence analysis of the Hantaan viruses isolated from Shaanxi Province and its Characteristics

M
a Yingxin，Yu Pengbo，Zhang Quanfu，Li Jiandong，Wang Shiwen，Li DexinNational Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China.（Ma YX，Zhang QF，Li JD，Wang SW，Li DX）Shaanxi Provincial Centre for Disease Control and Prevention，Xi′an 710054，Shaanxi，China（Yu PB）Ma Yingxin and Yu Pengbo are the first autlurs who contributed equally to this article

Li Dexin，Email：lidx@chinacdc.cn

Objective To sequence the who1e genome and to ana1yze the mo1ecu1ar and evo1utionary of Hantavirus（HV）iso1ated from periphera1 b1ood 1eukocytes（PBMC）of HFRS patients.Methods PBMC were iso1ated from periphera1 b1ood of HFRS patients and cocu1tured with Vero-E6 ce11s.Quantitative rea1-time RT-PCR and IFA tests were used to detect virus titer.The genome segments were amp1ified by PCR with predesigned primers，who1e sequence were obtained and further study on its evo1ution was ana1yzed. The differences between the iso1ate strains and Vaccine strain were tested by microneutra1ization test.Results Two Hantaan virus strains were iso1ated from PBMC of HFRS patients successfu11y.The who1e genomic fragments were obtained.Mo1ecu1ar phy1ogenetic ana1ysis resu1t showed that both of the strains had the comparative1y high simi1arity with XAAa10091712 strain.The seroneutra1ization titer of SX26 and Z10 had significant differences.Conclusion Hantaan virus cou1d be successfu11y iso1ated from PBMC of HFRS patients，and it proved to be a feasib1e way of iso1ation of hantavirus from periphera1 white b1ood ce11s；The microneutra1ization test proved that the antigenicity of two strains exist significant differences.It provided basis for the further study of hantavirus epidemic strains in this region.

Hantavirus；virus iso1ation；periphera1 b1ood mononuc1ear ce11；genome sequencing；phy1ogenetic ana1ysis；microneutra1ization test

国家科技重大专项课题“传染病实验室监测核心技术和技术体系研究”（2012ZX10004215）；国家科技支撑计划“黑热病、疟疾与病毒性出血热综合防治技术研究”（2014BAI13B05）

李德新，Emai1：1idx@chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.008

2016-02-26）