缬沙坦对雄性成年大鼠生殖功能安全性的初步探讨

赵艳玲，李兴旺，朱永林（.温州医科大学附属第二医院，浙江 温州3507；.温州市人民医院，浙江 温州35000）

缬沙坦对雄性成年大鼠生殖功能安全性的初步探讨

赵艳玲1，李兴旺1，朱永林2
（1.温州医科大学附属第二医院，浙江 温州325027；2.温州市人民医院，浙江 温州325000）

目的研究缬沙坦对雄性成年大鼠睾丸间质细胞发育的影响。方法40只90天龄SD雄性大鼠，随机分为对照组和缬沙坦组，每组20只，对照组给予玉米油（2mL/kg），缬沙坦组给予缬沙坦（15mg/kg）持续灌胃，灌胃7天后腹腔注射75 mg/kg二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）。EDS后第4天、14天、21天、35天各处死大鼠5只，采集血液、留取睾丸，采用放射免疫法（RIA）测定血清睾酮（T）、促黄体生成素（LH）水平；睾丸间质细胞特异性的羟类固醇 （3β-HSD）可由3β-HSD染色来鉴定，组织染色后使用图像分析软件估计睾丸间质细胞数。结果EDS后第4天、14天、21天、35天，两组血清T和LH水平差异无统计学意义（P＞0.05）；两组睾丸间质细胞数差异无统计学意义 （P＞0.05）。结论缬沙坦对雄性大鼠成年睾丸间质细胞发育无明显影响，对雄性成年大鼠生殖功能较安全，进一步研究需对睾丸间质细胞分化标志基因进行测定。

睾丸间质细胞；缬沙坦；睾酮；生殖功能

流行病学调查表明，慢性肾脏病（CKD）及高血压的发病呈现年轻化趋势，中青年男性人群高血压患病率逐年上升，降压/降低尿蛋白的控制血压、延缓肾功能进展的常规用药是ACEI（血管紧张素转化酶抑制剂）和ARB（血管紧张素受体拮抗剂）。大鼠睾丸间质细胞具有较高的血管紧张素Ⅱ （AⅡ）亲和性受体，此受体激活可抑制睾丸间质细胞膜腺苷酸环化酶活性，减少间质细胞释放睾酮［1］。缬沙坦是ARB的一种，目前其对成年雄性生殖内分泌细胞即睾丸间质细胞（adult Leydig cell，ALC）发育和功能的影响国内外尚无研究［2］，因其关乎优生优育，具有重要意义。本文就缬沙坦对雄性成年大鼠睾丸间质细胞发育的影响报道如下。

1　材料与方法

1.1材料40只90天龄SD雄性大鼠，体质量200～250g，平均（219.2±37.0）g，购自温州医科大学动物实验室 （清洁级）（编号 SCXK （沪）2013-0005），全部大鼠在正常温控光照和自由摄食条件下饲养。XH-6020γ计数仪、显微镜和数码相机由温州医科大学附属第二医院科研中心提供；缬沙坦（代文）由诺华公司提供；硝酸蓝四唑（NBT）购自Am resco公司；二甲基磺酸乙烷、醇酮购自稞新材料科技（上海）有限公司；睾酮（T）、促黄体生成素（LH）测定试剂盒（testosterone reagent kit）购自天津九鼎公司。

1.2方法40只90天龄SD雄性大鼠，随机分为对照组和缬沙坦组，每组20只，对照组给予溶媒玉米油（2mL/kg），缬沙坦组按照15mg/kg予以缬沙坦持续灌胃，每天1次，灌胃7天后，腹腔单次注射给予每只大鼠 75mg/kg二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）处理，EDS是一种烷化剂，高度选择性杀死睾丸间质细胞，大鼠接受单次腹腔注射75mg/kg EDS后，4天时清除睾丸间质细胞，睾丸间质内不能见到睾丸间质细胞。EDS处理后第4天、14天、21天、35天各处死大鼠5只，采集血液、留取睾丸。血液以3000r/min离心20分钟，收集血清，保存于-20℃，用于血清T、LH水平测定；冰冻睾丸，进一步组织化学染色。

1.3检测指标

1.3.1激素水平测定采用放射免疫测定法测定血清T、LH水平。按照试剂盒操作步骤，使用标准血清和样品，分别加入125I-T和125I-LH作为闪标，进行测定，T和LH的批内变异系数＜8%，批间变异系数＜10%。

1.3.2组织化学染色睾丸间质细胞通过组织化学染色进行鉴定。方法：取睾丸冰冻切片，厚8μm。睾丸间质细胞具有特异性标志物，即羟类固醇脱氢酶 （3β-HSD）。在该酶的作用下，0.4mmol醇酮、1mg NBT和辅酶（NAD+）发生反应，NBT被还原，生成蓝色双蚁脂沉淀沉积于睾丸间质细胞的胞浆部位。用二脒基苯基吲哚（DAPI）染细胞核。睾丸切片通过上述组织化学染色后，连接到计算机的显微镜和数码相机来观察染色情况，并使用图像分析软件估计细胞数（计数每100个小管中含有蓝色双蚁脂沉淀细胞数）。

1.4统计学处理采用SPSS11.5进行统计学分析，数值采用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。

2　结果

2.1血清T、LH水平EDS后第4天、14天、21天、35天，两组血清T和LH水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　两组血清T、LH水平的比较（x±s，ng/mL）

2.2睾丸间质细胞数采用3β-HSD染色测定EDS处理后第4天、14天、21天、35天两组睾丸间质细胞见图1～4。在EDS处理后第4天、14天、21天、35天，两组睾丸间质细胞数差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图1　EDS处理后第4天两组睾丸间质细胞（1A：对照组；1B：缬沙坦组）

图2　EDS处理后第14天两组睾丸间质细胞（2A：对照组；2B：缬沙坦组）

图3　EDS处理后第21天两组睾丸间质细胞（3A：对照组；3B：缬沙坦组）

图4　EDS处理后第35天两组睾丸间质细胞（4A：对照组；4B：缬沙坦组）

表2　两组睾丸间质细胞数的比较（x±s）

3　讨论

雄性哺乳动物体内睾酮主要由睾丸间质细胞分泌，因而睾酮含量的下降很大程度上与间质细胞功能相关，血清中低睾酮水平通过负反馈机制引起LH分泌增多。EDS处理模型可以很好地观察成年睾丸间质细胞发育过程［3-4］。单次腹腔注射EDS后，成年睾丸内间质细胞被完全清除。睾丸间质细胞的丧失导致循环内LH升高，LH同其他局部生长因子和细胞因子促进睾丸间质细胞前体细胞的增生和分化。血清睾酮是反映睾丸间质细胞再生的指标［5］。本实验中血清T在EDS处理后第4天没有测出，但之后恢复，说明睾丸间质细胞发育。

大鼠睾丸间质细胞具有较高的血管紧张素Ⅱ（AⅡ）亲和性受体，此受体激活可抑制睾丸间质细胞膜腺苷酸环化酶活性，减少间质细胞释放睾酮［1］。缬沙坦为血管紧张素受体拮抗剂，可能影响睾丸间质细胞膜腺苷酸环化酶活性及间质细胞释放睾酮，可能增加局部血管紧张素浓度，进而影响精子发生过程和下丘脑-脑垂体-睾丸轴分泌功能。目前国内外尚无相关研究。

本实验分别测定EDS处理后第4天、14天、21天、35天两组T及LH水平，EDS处理后第4天两组LH均较高，而T不能测出；第35天时两组T较高，而LH较低，两组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），故缬沙坦对成年睾丸间质细胞发育过程影响不大。研究中采用3β-HSD染色测定EDS处理后第4天、14天、21天、35天睾丸间质细胞数，发现第4天两组少见睾丸间质细胞，此后逐渐增多，第35天时较多，同时间段两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），缬沙坦未导致EDS处理后成年大鼠睾丸间质细胞数发生明显改变，说明缬沙坦对雄性成年大鼠生殖功能安全性较好。

通过实验证实，应用缬沙坦治疗，短期内未见睾丸间质细胞增生发生异常，但长期使用或加倍剂量使用的安全性有待进一步观察，包括睾丸间质细胞分化情况、测定睾丸间质细胞分化基因等。

［1］ 刘继红，凌青.高血压与勃起功能障碍相互关系研究进展.中华男科学杂志，2011，17（8）：675

［2］ Leung PS，Sernia C.The renin-angiotensin system and male reproduction；newfunctionsforoldhormones.JMol Endocrinol，2003，30（3）：263

［3］Ariyaratne HB，Mills N，Mason JI，et al.Effects of thyroid hormone on Leydig cell regeneration in the adult rat following ethane dimethane sulphonate treatment.Biol Reprod，2000，63（4）：1115

［4］ Ariyaratne S，Kim I，Mills N，et al.Mendis-Handagama C. Effects of ethane dimethane sulfonate on the functional structure of the adult rat testis.Arch Androl，2003，49 （4）：313

［5］Akingbemi BT，Ge R，Klinefelter GR，et al.Phthalateinduced Leydig cell hyperplasia is associated with multiple endocrine disturbances.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101 （3）：775

温州市科学技术局科技计划项目（Y20120042）