蚤休薯蓣皂苷联合顺铂治疗肺腺癌小鼠的疗效及其作用机制研究

邓日强，杨印楼，张宏华，程江涛，刘清毅，谢 斌，侯红梅



·论著·

蚤休薯蓣皂苷联合顺铂治疗肺腺癌小鼠的疗效及其作用机制研究

邓日强，杨印楼，张宏华，程江涛，刘清毅，谢 斌，侯红梅

512026广东省韶关市，粤北人民医院呼吸内科

【摘要】目的探讨蚤休薯蓣皂苷(RD)联合顺铂治疗肺腺癌小鼠的疗效及其作用机制。方法2015年12月，选取SPF级雄性T739小鼠48只，接种肿瘤细胞4 d后随机分为对照组、顺铂组、RD组、顺铂+RD组，每组12只。对照组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液，顺铂组小鼠接种肿瘤细胞后第5、12、19天腹腔注射顺铂，RD组小鼠接种肿瘤细胞4 d后腹腔注射RD，顺铂+RD组小鼠腹腔注射顺铂+RD。接种肿瘤细胞后第31天处死各组小鼠，比较4组小鼠体质量、肿瘤体积、肿瘤重量、抑瘤率、肺表面转移结节数，血清血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)水平，瘤组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管生成抑制蛋白(VASH)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)表达情况。结果顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠体质量、肿瘤重量低于对照组，肿瘤体积小于对照组，肺表面转移结节数少于对照组(P<0.05)；顺铂+RD组小鼠体质量、肿瘤重量低于顺铂组、RD组，肿瘤体积小于顺铂组、RD组，抑瘤率高于顺铂组、RD组，肺表面转移结节数少于顺铂组、RD组(P<0.05)。顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于对照组(P<0.05)；顺铂+RD组小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于顺铂组、RD组(P<0.05)。顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平低于对照组(P<0.05)；顺铂+RD组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平低于顺铂组、RD组(P<0.05)。结论RD联合顺铂能有效抑制小鼠肺腺癌细胞生长，降低血清VEGF、MMP-2水平及肿瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF的表达。

【关键词】腺瘤病，肺；顺铂；蚤休薯蓣皂苷；中西医结合疗法

邓日强，杨印楼，张宏华，等.蚤休薯蓣皂苷联合顺铂治疗肺腺癌小鼠的疗效及其作用机制研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2016，24(7)：56-60.[www.syxnf.net]

DENG R Q，YANG Y L，ZHANG H H，et al.Curative effect and mechanism of rhizome dioscin combined with cisplatin in treating rats with lung adenocarcinoma[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(7)：56-60.

肺腺癌源于支气管黏膜或腺体[1]，其倾向于管外生长，也可循泡壁蔓延，癌瘤内血管丰富，局部浸润和血行转移发生较早，患者预后极差[2]。化疗在肺腺癌的治疗中具有重要地位，抗肿瘤化疗药物有抑制癌细胞生长、增殖和杀灭癌细胞的作用，但常用的化疗药物多存在骨髓抑制、神经毒性、肝肾功能损伤、胃肠道反应等毒副作用，且部分化疗药物可产生耐药性，导致其临床应用有限，故临床加强肺腺癌综合治疗的研究十分必要[3]。目前，随着现代中医学的发展，从中草药中获取抗肿瘤药物已成为抗肿瘤研究的新热点。蚤休薯蓣皂苷(RD)是一种新型抗肿瘤药物[4]，其是从中药材蚤休中提取出的甾体皂苷(蚤休皂苷)，现代药理学研究表明，该成分具有抗肿瘤、调节心血管系统功能及免疫调节等作用。目前，临床有关RD治疗肺腺癌小鼠的较少。本研究通过建立肺腺癌小鼠模型，旨在探讨RD联合顺铂治疗肺腺癌小鼠的疗效及作用机制，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物2015年12月，选取SPF级T739小鼠48只，均为雄性，周龄4～5周，体质量18～22 g，购于中国医学科学院肿瘤医院动物实验室，动物合格证号：SCXK11-00-0005；饲养条件：12 h光照，室温23～25 ℃，相对湿度40%～60%。另选取LA795肺腺癌荷瘤鼠 2 只，由中国医学科学院肿瘤医院动物实验室提供。

1.1.2实验药物RD由天津马克生物技术有限公司生产，薯蓣皂苷单体纯度>95%；顺铂：江苏豪森药业股份有限公司生产，国药准字H20040813，规格：6 ml∶20 mg×5瓶/盒。

1.1.3实验试剂人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA定量检测试剂盒购自上海卡努生物科技有限公司；人基质金属蛋白酶2/明胶酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA试剂盒购自北京方程生物有限公司；免疫组化检测试剂盒购自上海一研生物科技有限公司；Anti-HIF-1 Alpha抗体购自上海微蒙酶联试剂公司；Anti-VASH1抗体购自上海博研生物工程研究中心；Anti-BFGF/FGF-2抗体购自上海研生生化试剂有限公司。

1.1.4实验仪器ELX800酶标仪由美国Biotek公司提供；MODEL 550台式冰冻离心机；BP110S型电子天平由德国Sartorins公司提供。

1.2实验方法

1.2.1建立模型无菌条件下断颈处死LA795肺腺癌荷瘤鼠后剥离瘤块，取肿瘤组织1 g+0.9%氯化钠溶液4 ml后放入表面皿内，剪碎肿瘤于匀浆机内研磨获取匀浆液，选择360目钢网过滤获得肿瘤细胞悬液，置入离心管内滴入0.9%氯化钠溶液，显微镜下调整细胞浓度达到2×106个/ml，后于T739小鼠右后腿根部外侧皮下注射肿瘤细胞悬液0.2 ml，获得小鼠皮下肿瘤动物模型。

1.2.2分组接种肿瘤细胞4 d后将所有T739小鼠随机分为对照组、顺铂组、RD组、顺铂+RD组，每组12只。(1)对照组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液，0.2 ml/次，1次/d，共26次。(2)顺铂组小鼠接种肿瘤细胞第5、12、19天腹腔注射顺铂，剂量为3 mg/kg，1次/d。(3)RD组小鼠接种肿瘤细胞4 d后腹腔注射RD，剂量为5 μg/kg，1次/d，共26次。(4)顺铂+RD组小鼠腹腔注射顺铂+RD，顺铂与RD的用法用量同上。接种肿瘤细胞后第31天处死各组小鼠。

1.3观察指标比较4组小鼠体质量、肿瘤体积〔计算公式：V=0.52×a2×b(a为短径，b为长径，V为体积)〕、肿瘤重量、抑瘤率〔抑瘤率=(1-ET/EC)×100%〕(EC为对照组平均瘤重，ET为治疗组平均瘤重)〕、肺表面转移结节数，血清血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)水平，瘤组织中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管生成抑制蛋白(VASH)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)表达水平。

1.3.1肺表面转移结节数处死小鼠后剖胸取出小鼠两肺后称两肺湿重，剥取皮下移植肿瘤及一侧肺组织标本，采用中性甲醛溶液固定，石蜡包理，组织切片，HE染色，光镜观察；另一侧肺组织置入液固定1 d，待肺组织收缩，转移瘤结节突出可见后取出，记录肺表面转移结节数。

1.3.2血清VEGF、MMP-2水平采集大鼠尾部静脉血5 ml，3 200 r/min离心5 min，采用ELISA 检测各组小鼠血清VEGF、MMP-2水平，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平肿瘤组织切片脱蜡至水，选择相应抗体作为一抗，选择生物素标记的羊抗兔抗体作为二抗，采用免疫组化染色检测各组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达情况，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4免疫组化判定方法HIF-1α主要表达于细胞核和细胞质；b-FGF主要表达于肿瘤细胞或肿瘤间质细胞内；VASH主要表达于细胞质或细胞核，呈黄色、棕黄色、褐色。采用Image-Proplus 6.0图像处理系统进行图片处理。

2　结果

2.1体质量、肿瘤体积、肿瘤重量、抑瘤率、肺表面转移结节数4组小鼠体质量、肿瘤体积、肿瘤重量、抑瘤率、肺表面转移结节数比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠体质量、肿瘤重量低于对照组，肿瘤体积小于对照组，肺表面转移结节数少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；顺铂+RD组小鼠体质量、肿瘤重量低于顺铂组、RD组，肿瘤体积小于顺铂组、RD组，抑瘤率高于顺铂组、RD组，肺表面转移结节数少于顺铂组、RD组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1Comparison of body mass，tumor volume，tumor weight，tumor inhibition rate and lung surface metastatic nodules number among the four groups

组别只数体质量(g)肿瘤体积(cm3)肿瘤重量(g)抑瘤率(%)肺表面转移结节(个)对照组1226.0±1.811.3±2.58.9±2.1-5.3±1.7顺铂组1224.1±1.7ab4.6±1.6ab4.3±1.3ab51.69±6.21b1.9±0.8abRD组1224.5±2.0ab6.9±2.1ab5.7±1.5ab35.96±5.50b2.8±1.1ab顺铂+RD组1223.8±1.9a2.8±1.4a2.4±1.2a73.03±8.940.8±0.4aF值7.91638.67122.09427.81555.033P值0.038<0.001<0.001<0.001<0.001

注：RD=蚤休薯蓣皂苷；与对照组比较，aP<0.05，与顺铂+RD组比较，bP<0.05；“-”表示无相关数据

2.2血清VEGF、MMP-2水平4组小鼠血清VEGF、MMP-2水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；顺铂+RD组小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于顺铂组、RD组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平4组小鼠HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；顺铂+RD组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平低于顺铂组、RD组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3，见图1～3)。

Table 2Comparison of serum levels of VEGF and MMP-2 among the four groups

组别只数VEGF(ng/L)MMP-2(μg/ml)对照组12127.41±30.85319.62±47.83顺铂组1257.09±16.60ab215.66±28.97abRD组1288.17±19.96ab263.92±39.05ab顺铂+RD组1241.38±13.72a163.39±29.64aF值33.72642.095P值<0.001<0.001

注：VEGF=血管内皮生长因子，MMP-2=基质金属蛋白酶2；与对照组比较，aP<0.05，与顺铂+RD组比较，bP<0.05

Table 3Comparison of expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues among the four groups

组别只数HIF-1αVASHb-FGF对照组1236178.2±4829.113094.2±2208.614149.7±2681.4顺铂组1224987.3±2208.6ab9278.0±1883.9ab9833.0±2267.5abRD组1229879.5±3382.7ab11037.6±1966.4ab11985.7±2316.6ab顺铂+RD组1218693.9±2614.0a6630.9±1553.2a6993.2±1982.1aF值16.39518.03321.432P值<0.001<0.001<0.001

注：HIF-1α=缺氧诱导因子1α，VASH=血管生成抑制蛋白，b-FGF=碱性成纤维细胞生长因子；与对照组比较，aP<0.05，与顺铂+RD组比较，bP<0.05

注：A为对照组，B为顺铂组，C为RD组，D为顺铂+RD组

图14组小鼠瘤组织中HIF-1α表达情况(HE染色，×400)

Figure 1Expressions of HIF-1α in tumor tissues of the four groups

图3　4组小鼠瘤组织中b-FGF表达情况(HE染色，×400)

3　讨论

3.1肺腺癌常规化疗的缺陷有研究显示，肺癌的组织学亚型主要为鳞癌，腺癌约占5%[5]。近50年来，肺腺癌的发病率迅速升高，目前其已占全部肺癌的47%以上。肺腺癌倾向于管外生长，也可循泡壁蔓延，癌瘤内血管丰富，局部浸润和血行转移发生较早，患者预后极差、病死率较高[6]。化疗作为治疗肺腺癌的主要手段之一，其疗效较好，可明显抑制癌细胞的生长、增殖，并杀灭癌细胞。多数常规化疗药物具有骨髓抑制、神经毒性、肝肾功能损伤及胃肠道反应等毒副作用[7]，使患者机体组织及正常细胞受损，部分化疗药物可导致患者出现耐药性，故其临床应用有限。赵潇等[8]研究表明，RD具有下调胰腺癌患者PRDX1表达的作用，可造成活性氧簇(ROS)过度蓄积，导致细胞凋亡，已成为临床研究热点。

3.2顺铂联合RD治疗肺腺癌的可行性近年来，有研究者从中药及天然植物中提取出毒副作用较低的抗肿瘤有效成分，RD是一种由传统中药材蚤休主要有效成分甾体皂苷合成的抗肿瘤新药[8]。现代药理学研究表明，RD具有抗肿瘤、调节心血管系统及免疫系统功能等作用。有研究表明，RD具有较强杀灭肿瘤细胞的作用[9]，且不损伤正常细胞。有研究发现，RD对胶质瘤细胞有明显的抑制作用，其作用机制与上调脂肪酸合成酶(FAS)、半胱氨酸蛋白酶8(CASPASE-8)和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达及促进细胞凋亡有关[10]。有研究通过建立H22荷瘤肝癌小鼠模型，分别使用蚤休高、低剂量和环磷酰胺对模型小鼠进行腹腔灌洗[11]，结果显示，蚤休能明显抑制肿瘤生长，提高血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素2(IL-2)水平。本研究结果显示，顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠体质量、肿瘤重量低于对照组，肿瘤体积小于对照组，肺表面转移结节数少于对照组；顺铂+RD组小鼠体质量、肿瘤重量低于顺铂组、RD组，肿瘤体积小于顺铂组、RD组，抑瘤率高于顺铂组、RD组，肺表面转移结节数少于顺铂组、RD组。提示顺铂联合RD能增强化疗效果，且肿瘤抑制率较高，提示本研究综合治疗肺腺癌方案具有可行性。

3.3顺铂复合RD治疗肺腺癌的作用机制有研究显示，肿瘤细胞增殖可造成肿瘤内部组织缺氧，使肿瘤细胞快速增殖并出现耐药性，而肿瘤细胞会通过自身调节适应其内部微环境变化，从而造成HIF-1α等相关因子的表达出现变化[12]。缺氧条件下HIF-1α信号分子可与相关受体结合，刺激络氨酸蛋白激酶活性高表达，产生级联反应激活PI3K及促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路，引起HIF-1α表达水平升高，同时其在缺氧状态下还可驱动肿瘤细胞产生耐药性，导致肿瘤下游血管生成因子转录，生成大量肿瘤新生血管，促进恶性肿瘤生长。b-FGF及VEGF均可与其受体结合，基于Mek/Erk 通路促进成纤维细胞生长因子(FGF)结合蛋白表达水平上升，可诱导新肿瘤血管生成，促进血管内皮细胞增殖、趋化，同时可降解基底膜、提高血管通透性、增强肿瘤细胞的侵袭能力。VASH-1作为一种血管生成负反馈抑制因子，首次发现于VEGF或b-FGF诱导的人脐静脉内皮细胞DNA微阵列中。有研究表明，VASH-1高表达于恶性肿瘤细胞内，并与HIF-1α表达呈正相关[13]。本研究结果显示，顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平低于对照组；顺铂+RD组小鼠瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平低于顺铂组、RD组。提示顺铂联合RD可降低肺腺癌组织中HIF-1α、VASH、b-FGF表达水平，抑制肿瘤新生血管生成、生长、侵袭及转移能力。分析原因可能为RD可通过抑制缺氧条件下肺腺癌肿瘤细胞b-FGF表达，并阻断其基于PI3K通路对VEGF释放的刺激，影响条件血管内皮生长因子受体功能，从而降低HIF-1α和VASH的表达。

基质金属蛋白酶(MMPs)可降解细胞外基质及基底膜，增强肿瘤细胞侵袭及转移能力：(1)损坏肿瘤细胞间质膜物理屏障，重塑肿瘤细胞黏附力，使肿瘤细胞突破屏障向周围组织转移；(2)激活基质潜在的生物活性，引导肿瘤免疫逃逸；(3)改变细胞外基质生理性，诱导形成肿瘤新血管。故MMPs是降解细胞基底膜的高效酶类，其中MMP-2可有效促进肿瘤侵袭和转移，恶性肿瘤常伴有高表达的MMP-2[14-15]。本研究结果显示，顺铂组、RD组、顺铂+RD组小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于对照组；顺铂+RD组小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于顺铂组、RD组。提示顺铂联合RD可降低血清MMP-2水平，降低肿瘤细胞侵袭和转移能力，从而改善患者远期预后，抑制肿瘤复发。

综上所述，RD联合顺铂治疗小鼠肺腺癌能进一步抑制肿瘤生长，降低血清VEGF、MMP-2水平及肿瘤组织中HIF-1α、VASH、b-FGF的表达，值得临床推广应用。但本研究未对RD改善化疗产生的毒副作用及小鼠体内炎性因子变化进行探讨，有待进一步研究。

作者贡献：邓日强进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；张宏华、程江涛、刘清毅、谢斌、侯红梅进行实验实施、评估、资料收集；杨印楼进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：李洁晨)

基金项目：广东省韶关市卫生局项目(Y15023)

【中图分类号】R 734.2

【文献标识码】B

DOI:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.07.015

(收稿日期：2016-04-07；修回日期：2016-07-19)

Curative Effect and Mechanism of Rhizome Dioscin Combined with Cisplatin in Treating Rats with Lung Adenocarcinoma

DENGRi-qiang，YANGYin-lou，ZHANGHong-hua，CHENGJiang-tao，LIUQing-yi，XIEBin，HOUHong-mei.

DepartmentofRespiratoryMedicine，thePeople′sHospitalofNorthGuangdong，Shaoguan512026，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the curative effect and mechanism of rhizome dioscin combined with cisplatin in treating rats with lung adenocarcinoma.MethodsIn December 2015，a total of 48 specific pathogen free male T739 mice were selected，after 4 days of inoculation of tumor cells，all of the mice were randomly divided into A group，B group，C group and D group，each of 12 mice.Mice of A group received intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride injection，mice of B group received intraperitoneal injection of cisplatin after 5 days，12 days and 19 days of inoculation of tumor cells，mice of C group received intraperitoneal injection of rhizome dioscin after 4 days of inoculation of tumor cells，mice of D group received intraperitoneal injection of rhizome dioscin combined with cisplatin.All of the mice were killed after 31 days of inoculation of tumor cells，body mass，tumor volume，tumor weight，tumor inhibition rate，lung surface metastatic nodules number，serum levels of VEGF and MMP-2，expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues were compared among the four groups.ResultsBody mass and tumor weight of B group，C group and D group were statistically significantly lower than those of A group，tumor volume of B group，C group and D group was statistically significantly smaller than that of A group，respectively，and lung surface metastatic nodules number of B group，C group and D group was statistically significantly less than that of A group，respectively(P<0.05)；body mass and tumor weight of D group were statistically significantly lower than those of B group and C group，respectively，tumor volume of D group was statistically significantly smaller than that of B group and C group，respectively，tumor inhibition rate of D group was statistically significantly higher than that of B group and C group，respectively，lung surface metastatic nodules number of D group was statistically significantly less than that of B group and C group，respectively(P<0.05).Serum levels of VEGF and MMP-2 of B group，C group and D group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05)；serum levels of VEGF and MMP-2 of D group were statistically significantly lower than those of B group and C group(P<0.05).Expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues of B group，C group and D group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05)；expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues of D group were statistically significantly lower than those of B group and C group(P<0.05).ConclusionRhizome dioscin combined with cisplatin can effectively inhibit the tumor cell proliferation of lung adenocarcinoma in mice，reduce the serum levels of VEGF and MMP-2，down-regulated the expressions of HIF-1α，VASH，b-FGF in tumor tissues.

【Key words】Adenomatosis，pulmonary；Cisplatin；Rhizome dioscin；Integrated traditional Chinese and Western medicine therapy