白藜芦醇拮抗游离脂肪酸诱导的胰岛B细胞凋亡机制探讨

徐碧林,申　甜,夏　娟，喻　明，朱近悦，汪红平



白藜芦醇拮抗游离脂肪酸诱导的胰岛B细胞凋亡机制探讨

徐碧林*,申甜,夏娟，喻明，朱近悦，汪红平

上海市普陀区中心医院内分泌科,上海 200062

[摘要]目的探讨白藜芦醇拮抗游离脂肪酸诱导的体外培养的胰岛B细胞凋亡的可能机制。方法将10 μmol/L白藜芦醇和500 μmol/L棕榈酸同时作用于体外培养的胰岛B细胞。共分为3组:空白组(不含棕榈酸)、棕榈酸组(PA组,含500 μmol/L棕榈酸的脂性培养基)、白藜芦醇组(Res组，含10 μmol/L白藜芦醇+500 μmol/L棕榈酸)。以流式细胞术检测细胞凋亡，RT-PCR检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2 mRNA水平。结果与PA组相比，Res能显著降低B细胞凋亡率(95.82%±1.94% vs.11.03%±1.08%，P<0.01)，降低Bax mRNA(0.185±0.005 vs.0.161±0.003，P<0.01)，升高Bcl-2 mRNA(0.004±0.001 vs.0.008±0.001，P<0.01)。结论白藜芦醇能拮抗棕榈酸诱导的胰岛B细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡相关蛋白有关。

[关键词]细胞凋亡;白藜芦醇;棕榈酸

0　引言

2型糖尿病常合并脂代谢紊乱，在2002年美国糖尿病协会年会上，McGarry提出了“糖尿病是糖脂病”的概念。“脂毒性”在糖尿病的发生、发展中起着重要的作用。游离脂肪酸可以通过多种途径导致胰岛B细胞凋亡，如激活氧化应激[1]、诱导凋亡相关因子[2]失衡、内质网应激[3]等。白藜芦醇属于一种酚类植物抗毒素，近年来的研究表明，白藜芦醇具有明显的降低血糖、改善糖尿病的作用。其具体机制尚未完全明了。我们的前期研究结果表明，在一定浓度范围内，白藜芦醇可以明显抑制游离脂肪酸引起的B细胞凋亡[4]。本研究将进一步探讨其抑制B细胞凋亡的可能机制。

1　材料与方法

1.1实验材料小鼠胰岛素瘤细胞(β-TC-6细胞株)(中国科学院上海细胞生物学研究所),白藜芦醇、棕榈酸(上海安谱生物科技有限公司),DMEM高糖培养基(Hyclone),优质胎牛血清(Biowest南美血源),AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司),逆转录酶SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase(R250-01,invitrogen)；荧光染料SYBR Green I(CS7561，invitrogen),5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱(Shell-Lab公司)，流式细胞仪(BD FACSCALIBUR),荧光定量PCR仪(CFX96TMReal-Time Systerm,Bio Rad)。

1.2细胞培养培养β-TC-6细胞至对数生长期,接种于96孔板,每孔细胞数3×104。根据培养基中是否含棕榈酸及不同白藜芦醇浓度,设立3组,分别为:空白组(不含游离脂肪酸的条件培养基)、棕榈酸组(含500 μmol/L棕榈酸的脂性培养基)、白藜芦醇组(10 μmol/L白藜芦醇+500 μmol/L棕榈酸)，每组浓度设6个复孔。置于含5% CO2的37 ℃恒温细胞培养箱中,观察细胞生长形态。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡上述各组细胞培养24 h后加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min，2次后弃上清,每样本加200 μL Binding Buffer重悬细胞后加入10 μL AnnexinV-FITC,轻轻混匀,置室温避光孵育15 min,加入5 μL碘化丙啶(PI),置相同条件下孵育5 min,1 h内入流式细胞仪检测凋亡细胞和正常细胞比率。

1.4RT-PCR法检测Bax、Bcl-2 mRNATrizol法抽提各组细胞RNA，反转录到cDNA后，进行QPCR扩增,将通过的基因Ct值拷贝到《QPCR相对定量计算表》中，选择对照样品，完成计算分析。Bax、Bcl-2引物应用primer premier 5软件设计，由上海诺百生物科技有限公司合成。Actin：agggaaatcgtgcgtgac，gctcattgccgatagtg；Bcl-2：ggggctacgagtgggatact，gacggtagcgacgagagaag；Bax：gcgaattggcgatgaactgg，tagaaaagggcaaccacccg。Bax、Bcl-2 mRNA的PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 45 s,40个循环，95 ℃ 10 s，每秒降0.5 ℃，65 ℃ 0.05 s读板。

2　结果

2.1白藜芦醇和棕榈酸对β-TC-6细胞凋亡的影响培养24 h后，棕榈酸组、白藜芦醇组细胞凋亡率均高于空白组(P<0.05)；白藜芦醇组细胞凋亡率较棕榈酸组明显下降(P<0.01)，细胞存活率较棕榈酸组明显升高(P<0.01)。见表1。

表1　流式细胞术检测细胞存活和凋亡率(%)

注：与空白组比较,*P<0.05；与棕榈酸组比较,#P<0.01

2.2各组Bax、Bcl-2 mRNA结果培养24 h后，棕榈酸组、白藜芦醇组Bax水平高于空白组，Bcl-2水平低于空白组(P<0.01)；白藜芦醇组Bax水平低于棕榈酸组，Bcl-2水平高于棕榈酸组(P<0.01)。见表2。

表2　各组Bax、Bcl-2 mRNA结果

注：与空白组比较,*P<0.01；与棕榈酸组比较,#P<0.01

3　讨论

2型糖尿病以胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能受损为特征。其中B细胞功能受损在2型糖尿病的发生中起决定作用。已有研究表明，B细胞高水平的凋亡是胰岛B细胞功能受损的主要原因[5]。因此，抑制B细胞凋亡，可保护B细胞功能，从而有效缓解糖尿病病情。

在2型糖尿病中，线粒体途径是胰岛B细胞凋亡的主要信号转导途径。线粒体途径是由抗凋亡蛋白(如B淋巴细胞瘤蛋白家族Bcl-2、Bcl-xl等)与促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bid等)的异常改变导致线粒体外膜通透性改变，内膜中的细胞色素C(Cyt-C)释放入胞质，与凋亡蛋白酶激活因子1和前caspase-9、ATP形成凋亡体，活化caspase-9，从而激活效应caspase-3、6、7，导致凋亡。Bcl-2家族成员可通过改变线粒体外膜通透性而调控线粒体活化，在线粒体诱导的凋亡途径中起重要作用。Lupi等[6]发现，与游离脂肪酸共同培养的人胰岛细胞Bcl-2 mRNA明显降低，细胞凋亡率显著提高。Federici等[7]在比较了高糖浓度和正常糖浓度下培养人胰岛细胞5 d后的凋亡情况，发现抗凋亡基因Bcl-2没有变化，而促凋亡基因Bax、Bak、Bid在高糖浓度下均过度表达，因此，Bcl家族中抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡可能是决定细胞是否发生凋亡的关键。

白藜芦醇是一种天然的多酚类化合物，主要存在于各种红葡萄果实和红葡萄酒中，其在中药虎杖中的含量远高于葡萄等其他植物。诸多研究表明，白藜芦醇对于肿瘤、脑缺血、心血管疾病均有良好的治疗作用。尤其近年来研究发现，白藜芦醇还具有降低血糖，改善糖尿病的作用。其机制可能有：促进细胞内葡萄糖的转运，改善胰岛素敏感性[8]；改善胰岛素分泌[9]；增加胰升糖素样肽1(GLP-1)分泌[10]。

本研究结果显示，棕榈酸能够明显增加胰岛B细胞凋亡，升高Bax水平，降低Bcl-2水平，证实了游离脂肪酸可通过Bcl-2家族引起B细胞凋亡，这与国外报道一致[6,11]。我们的前期研究结果表明，白藜芦醇在一定浓度范围内可以明显抑制胰岛B细胞凋亡，且这种作用在10 μmol/L时作用最强[4]，因此，本研究选择10 μmol/L为白藜芦醇浓度。结果显示，10 μmol/L的白藜芦醇能够明显降低促凋亡蛋白Bax水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2水平，提示白藜芦醇可能直接参与了线粒体途径，从而调控胰岛B细胞的凋亡。

综上所述，白藜芦醇能明显拮抗棕榈酸诱导的胰岛B细胞凋亡，其机制可能与其改变了抗凋亡蛋白以及促凋亡蛋白的表达有关。

参考文献：

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[2]Lang F,Ulrich S,Gulbins E,et al.Ceramide formation as a target in beta-cell survival and function[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(9):1061-1071.

[3]Karaskov E,Scott C,Zhang L,et al.Chronic palmitate but not oleate exposure induces endoplasmic reficulum stress which may contribute to INS-l pancreatic β-cell apoptosis[J].Endocrinology,2006,147(7):3398-3407.

[4]徐碧林,申甜,喻明,等.白藜芦醇对游离脂肪酸诱导的胰岛B细胞凋亡的影响[J].山东医药,2015,55(8):11-13.

[5]Rhodes CJ.Type 2 diabetes-a matter of β-cell life and death[J].Science,2005,307(5708):380-384.

[6]Lupi R,Dotta F,Mareseli L,et al.Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets:evidence that beta-cell death is caspase mediated,sect1ially dependent on ceramide pathway,and Bcl-2 regulated[J].Diabetes,2002,51(5):1437-1442.

[7]Federici M,Hribal M,Perego L,et al.High glucose causes apoptosis in cultured human pancreatic islets of Langerhans:a potential role for regulation of specific Bcl family genes toward an apoptotic cell death program[J].Diabetes,2001,50(6):1290-1301.

[8]Burgess TA,Robich MP,Chu LM,et al.Improving glucose metabolism with resveratrol in a swine model of metabolic syndrome through alteration of signaling pathways in the liver and skeletal muscle[J].Arch Surg,2011,146(5):556-564.

[9]Lee YE,Kim JW,Lee EM,et al.Chronic resveratrol treatment protects pancreatic islets against oxidative stress in db/db mice[J].PLoS ONE,2012,7(11):e50412.

[10]Knop FK,Konings E,Timmers S,et al.Thirty days of resveratrol supplementation does not affect postprandial incretin hormone responses,but suppresses postprandial glucagon in obese subjects[J].Diabet Med,2013,30(10):1214-1218.

[11]Hirota N,Otabe S,Nakayama H,et al.Sequential activation of caspases and synergistic β-cell cytotoxicity by palmitate and anti-Fas antibodies[J].Life Sci,2006,79(13):1312-1316.

收稿日期：2015-09-17

基金项目：上海市卫生局基金课题(20124265)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603003

Mechanism of resveratrol in inhibiting apoptosis of B cells induced by palmitic acidinvitro

XU Bi-lin*,SHEN Tian,XIA Juan,YU Ming,ZHU Jin-yue,WANG Hong-ping

(Desect1ment of Endocrinology,Shanghai Putuo District Central Hospital,Shanghai 200062,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of resveratrol in inhibiting apoptosis of B cells induced by palmitic acid (PA),a free fatty acid,in vitro.MethodsB cells were treated with 10 μmol/L resveratrol+500 μmol/L palmitic acid in vitro,and were divided into three groups: blank group (excluding free fatty acids),PA group (500 μmol/L palmitic acid lipid medium),resveratrol group (10 μmol/L resveratrol+500 μmol/L palmitic acid),respectively.The percentage of apoptotic cells was calculated by flow cytometry.Bax and Bcl-2 mRNA were measured by RT-PCR.ResultsAt 24 h,compared with PA group,resveratrol could significantly decrease B cells apoptosis percentage (95.82%±1.94% vs.11.03%±1.08%,P<0.01) and Bax mRNA (0.185±0.005 vs.0.161±0.003,P<0.01),elevate Bcl-2 mRNA (0.004±0.001 vs.0.008±0.001,P<0.01).ConclusionResveratrol can significantly inhibit B cell apoptosis induced by palmitic acid in vitro.The mechanism may be related to the regulation of resveratrol on some apoptosis protein.

Key words：Cell apoptosis; Resveratrol; Palmitic acid