喜树碱及其衍生物对肝癌细胞HepG2增殖抑制与凋亡的研究

陈琴华，余　飞，李　鹏，朱　军



喜树碱及其衍生物对肝癌细胞HepG2增殖抑制与凋亡的研究

陈琴华，余飞，李鹏*，朱军

湖北医药学院附属东风医院药物分析与筛选研究所，湖北 十堰 442008

[摘要]目的探讨喜树碱(CPT)及其衍生物10-羟基喜树碱(HCPT)、7-乙基喜树碱(SN22)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)在体外对肝癌细胞HepG2增殖抑制与凋亡的影响。方法取对数期生长的HepG2细胞，分为对照组以及实验组，将4种药物配成浓度梯度0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的药物溶液。将不同浓度的药物溶液作用于肝癌细胞48 h，MTT法测定HepG2细胞的增殖情况,Anexin V-PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果MTT法显示，4种药物对肝癌细胞HepG2的增殖具有抑制作用，在一定范围内随着药物浓度的增加，对HepG2细胞增殖的抑制作用逐渐增强，呈量效依赖关系，其中7-乙基-10-羟基喜树碱抑制效果最好，10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱次之，喜树碱抑制效果最差。不同浓度的喜树碱及衍生物处理肝癌细胞HepG2，与对照组比较差异有统计学意义，随着药物浓度的变化，细胞凋亡也呈现梯度变化,结构修饰后的SN38比SN22、HCPT及CPT作用更强。结论喜树碱及衍生物对肝癌细胞HepG2有抑制作用，并且能够诱导细胞凋亡。

[关键词]喜树碱；10-羟基喜树碱；7-乙基喜树碱；7-乙基-10-羟基喜树碱；HepG2细胞

0　引言

肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，早期发现困难，临床病程短，进展迅速，中位生存期仅3～6个月。治疗上以手术切除为主，但多数患者确诊时已丧失手术时机。非手术治疗以肝动脉栓塞化疗为首选，经皮肝穿瘤体内冷冻、射频、无水乙醇及抗癌药物注射治疗也有一定效果，针对肝癌常选用的化疗药物有顺铂、阿霉素、丝裂霉素、羟基喜树碱等[1-3]。喜树碱属于萜类吲哚生物碱，由Wall等首次从我国特有物种喜树的茎部分离纯化得到。1985年，Hisang等发现，喜树碱能通过特异性地阻断拓扑异构酶Ⅰ(Topoisomerase Ⅰ，Topo Ⅰ)的合成抑制癌细胞增殖，区别于以往对拓扑异构酶Ⅱ(Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ)为靶点进行攻击的抗癌药物，因而备受关注。而后研究者们又通过对CPT环7、9、10、11位的结构改造，获得了拓扑替康、依立替康、勒托替康、羟基喜树碱(HCPT)、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、DB-67(7-t-butyldimethylsilyl-10-hydroxycamptothecin)等，其中拓扑替康和CPT-11、HCPT已用于临床治疗结肠癌、卵巢癌和小细胞肺癌[4-7]。目前提出的喜树碱类可能的抗肿瘤机制包括细胞凋亡通路、信号通路、细胞周期和端粒损伤作用等[8-13]。本实验通过HepG2细胞株在喜树碱及其衍生物7-乙基-喜树碱、10-羟基-喜树碱、7-乙基-10-羟基-喜树碱的作用下，与对照组对比观察其细胞的增殖抑制情况以及凋亡率，初步判断药物的抗癌疗效，为临床用药提供基础。

1　资料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂喜树碱(西安汇林生物科技有限公司，含量：99.32%，批号：20130301)，10-羟基喜树碱(西安汇林生物科技有限公司，含量:99.26%，批号：20130301)，7-乙基喜树碱(西安汇林生物科技有限公司，含量：99.23%，批号：20130301)，7-乙基-10-羟基喜树碱(西安汇林生物科技有限公司，含量：99.13%，批号：20130301)，DMEM(Gibco，USA)，新生牛血清FBS(杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑(MTT,美国Sigma公司)，二甲基亚枫(DMSO，日本进口)，96孔细胞培养板(Corning，USA)，Annexin V-PI试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.1.2仪器CKX-31倒置显微镜(Olympus)，CO2孵育箱(Therma)，MQX200型酶标仪(BioTek)，FACS Calibur型流式细胞仪(BDFACSCalibur)。

1.1.3细胞株HepG2细胞株购自西安交通大学医学院，培养于含10%的胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱中传代培养。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组将人体肝癌细胞HepG2用含10%胎牛血清、DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养，按常规方法消化、传代，待细胞长至80%融合时进行实验。所有实验均在细胞对数生长期进行。将细胞分为对照组和给药组，即喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱的不同浓度实验组。

1.2.2MTT法检测细胞增殖抑制率取处于对数生长期的HepG2细胞加入胰蛋白酶消化，吹打制成单个细胞悬液，调整细胞密度为104个/mL，以每孔体积200 μL接种于96孔培养板上。培养24 h，待细胞贴壁后更换含不同浓度喜树碱以及衍生物的药物培养基，对照组加等体积的培养液，每组设6个复孔，将细胞置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度的培养箱中培养48 h后，每孔加入180 μL新鲜DMEM培养液，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h后弃去上清液，轻轻扣板于滤纸上，每孔加入DMSO溶液200 μL，置于摇床上振荡3 min使结晶充分溶解，用酶标仪在490 nm波长处测各孔的光密度值(OD值)，然后计算不同浓度的喜树碱以及衍生物对细胞的生长抑制情况，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100%，并计算IC50值。

1.2.3Anexin V-PI染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率培养箱中培养细胞至对数生长期，消化吹打成单细胞悬液后用培养基稀释，调整细胞浓度为2×106个/mL，接种于6孔板内，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2的培养箱培养，直到细胞贴壁良好，细胞处于对数生长期，细胞长至孔底面积70%或80%左右时，弃去原培养液，加入含药培养基，作用48 h后收集各组细胞。按试剂盒操作，将各组细胞离心，预冷PBS洗涤弃上清，残渣细胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V和 5 μL PI，避光静置15 min，加300 μL预冷PBS，振荡混匀上机。

2　结果

2.1喜树碱及其衍生物对HepG2细胞增殖的影响喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱类药物在作用48 h后均呈现对细胞增殖的抑制作用，不同药物不同浓度细胞增殖抑制率差异有统计学意义(P<0.05)，随着作用浓度增加，抑制作用越明显，增殖抑制作用的大小呈浓度依赖性(见图1)。4种药物对肝癌细胞HepG2抑制作用强弱依次为7-乙基-10-羟基喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、喜树碱。7-乙基-10-羟基喜树碱相同浓度时表现出最大的抑制作用，0.01 μmol/L时的抑制率为17.04%，1 μmol/L时的抑制率为59.91%，10 μmol/L时的抑制率增至70.50%；喜树碱表现出最小的增殖抑制作用，0.1 μmol/L时的抑制率为3.82%，1 μmol/L时的抑制率增至36.21%，10 μmol/L时的抑制率增至43.33%。10-羟基喜树碱与7-乙基喜树碱药物对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用接近，但随着浓度的增加，7-乙基喜树碱的增殖抑制率较10-羟基喜树碱升高更为明显。4种药物的IC50分别为1.859 1、3.363 3、6.265 9、8.523 3 μmol/L。

图1　喜树碱及衍生物对肝癌细胞HepG2的抑制曲线图

2.2喜树碱及其衍生物对HepG2细胞凋亡的影响运用Annexin V-FITC/PI双染色结合流式细胞术观察并计算喜树碱诱导细胞凋亡率，得到药物浓度-凋亡率图，见图2。喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱对肝癌细胞HepG2凋亡影响的结果显示，对照组48 h后的凋亡率为8.93%。肝癌细胞HepG2在4种药物作用下细胞凋亡率较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)，且不同药物的凋亡率随浓度的增加呈不同幅度升高，总体作用结果呈现浓度依赖性。说明喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱能促进肝癌细胞HepG2的凋亡，其中7-乙基-10-羟基喜树碱诱导效果最为明显(见图3)，喜树碱最弱。

图2　喜树碱及衍生物对肝癌细胞HepG2的流式细胞图

图3　SN38浓度依赖性流式细胞凋亡率图以及HCPT和SN22在10 μmol/L的流式凋亡图

3　讨论

喜树碱主要是通过抑制肿瘤细胞中Topo Ⅰ的活性来发挥抗肿瘤作用。TopoⅠ是一种与DNA复制、重组和转录有关的细胞核内酶。处于S期的细胞对喜碱类药物诱导凋亡更为敏感，S期细胞易感原因与DNA复制有关。当细胞DNA在大量复制活跃时，TopoⅠ剪切DNA双链形成的TopoⅠ-DNA可裂解复合物，喜树碱能与其结合，形成CPT-TopoⅠ-DNA三元复合物，使可逆的可解离复合物转变成不可逆的复合物，抑制由TopoⅠ介导的DNA裂解和重新连接反应，最终引起DNA链断裂，从而导致细胞死亡[14-16]。

本实验也进一步证实了喜树碱及其衍生物对肝癌细胞HepG2具有较明显的抑制作用。自喜树碱被发现以来，一直具有良好的抗癌效果，到目前为止，经过优化结构得到一系列的衍生物也在临床上广泛使用。本实验结果表明，喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱呈浓度依赖性显著抑制肝癌细胞的增殖，尤其是7-乙基-10-羟基喜树碱在癌细胞增殖方面有很强的抑制作用。细胞凋亡情况显示喜树碱及其衍生物对肝癌细胞HepG2有良好的凋亡诱导作用，与正常组比较，早期与晚期凋亡百分比均明显提高，其中7-乙基-10-羟基喜树碱诱导作用最佳。

综上所述，喜树碱以及衍生物对肝癌细胞HepG2具有良好的抑制增殖和诱导凋亡作用，具有良好的开发空间，有望给临床用药提供基础。

参考文献：

[1]郑晓龙.抗肿瘤药物喜树碱的研究进展[J].中国现代药物应用,2014,9(19)：245-246.

[2]代鲁平,宋春霞，邵先祥,等.抗癌药物喜树碱类衍生物的研究进展[J].中国药学杂志,2010,45(23)：1813-1815.

[3]周晶琳，陆迪，祝慧慧.喜树碱治疗肿瘤的进展[J].牡丹江医学院学报，2012,33(3)：59-60.

[4]黄石麟，孙莲莉.喜树的化学成分和生物活性研究概况[J].中国药学杂志，2013,48(13):1048-1051.

[5]胡文晋，胡巍，方芸.喜树碱类药物抗肿瘤机制研究进展[J].中国药房，2012，23(27)：2581.

[6]胡蓉蓉，陈军，杨希雄，等.9-硝基喜树碱研究进展[J].2012,28(5):498-500.

[7]郭娜，江都，温少鹏,等.羟基喜树碱10，20位双取代衍生物的合成及活性评价[J].天津科技大学学报，2014,29(6):7-10.

[8]万亮琴，刘亚明，李芳赫,等.喜树碱诱导小鼠皮层神经元凋亡的实验研究[J].中医药导报，2015,21(7)：26-30.

[9]万亮琴，杜庆红，李卫红，等.从DNA转录角度探讨喜树碱类药物的神经毒性[J].中医药导报，2015,21(1)：9-16.

[10]许光明，贺香嫦，林丽美，等.10-羟基喜树碱对肝癌细胞HepG2 DNA甲基化水平的调节作用研究[J].中国药房，2014,25(45)：4245-4247.

[11]沈少华，刘姬艳，胡江琴，等.喜树碱生物合成途径及其相关酶的研究进展[J].中草药，2011,42(9):1862-1868.

[12]宋海星，胡洪华.羟基喜树碱抑制肺癌A549细胞的体外增殖并下调Bcl-2 基因的表达[J].南方医科大学学报，2012,32(9)：1341-1345.

[13]封蔚莹，宋春娇,张志坚,等.喜树碱衍生物SN-38对人白血病细胞系HL-60增殖及凋亡作用的实验研究[J].中华中医药学刊，2014,32(6)：1406-1409.

[14]Day Bhanu M，Kondapi AK.Neurotoxic activity of atopoisomerase-I inhibitor，camptothecin，in cultured cerebellar granule neurons[J].Neurotoxicology，2010，31(6)：730-737.

[15]邹磊,郭巍,缪震元,等.高喜树碱类拓扑异构酶Ⅰ抑制剂的研究进展[J].中国药物化学杂志，2012,12(4)：323-329.

[16]郭小鹏，冯思良.拓扑异构酶及其喜树碱类抑制剂的临床研究进展[J].国际药学研究杂志,2013,40(4):405-414.

收稿日期：2015-08-25

基金项目：湖北省教育厅科学技术研究项目(D20152105)；十堰市科学技术研究与开发项目(15Y48)；湖北省自然科学基金面上项目(2015CFB615)；湖北医药学院优秀中青年科技创新团队计划(2014CXG04)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603004

Research on the effect of camptothecin and its derivatives on proliferation and apoptosis of liver cancer cell HepG2

CHEN Qin-hua,YU Fei,LI Peng*,ZHU Jun

(Desect1ment of Medical Experiment Center,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of camptothecin (CPT) and its derivatives 10-hydroxy camptothecin (HCPT),7-ethyl camptothecin (SN22),7-ethyl-10-hydroxy camptothecin (SN38) on inhibition of hepatoma cell line HepG2 and induction of its apoptosis.MethodsThe vegetative HepG2 cells of logarithmic phase were assigned as control group and experimental group.Four drugs were made to different concentrations,which were 0.01,0.1,1,10,100 μmol/L.Different concentrations of drug solutions were effected on HepG2 cells in 48 h,then MTT method was used to detect the proliferation of HepG2 cell and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry (FCM) using Anexin V-PI staining.ResultsThe results by MTT method showed four drugs had inhibitory effect on proliferation of HepG2 cells,moreover,the proliferation inhibition of HepG2 cells was enhanced gradually with the increase of drug concentrations in a certain scope drug concentrations,and the proliferation inhibition was dependent on drug concentration.The sequences of proliferation inhibition were SN38,HCPT,SN22,and CPT.With different concentrations of camptothecin and derivatives with HepG2 liver cancer cells,there were significant differences compared with control group,and as drug concentration changed,cell apoptosis also presents gradient change;structure modification of SN38 was stronger than SN22,CPT and HCPT function by FCM using AnexinV-PI staining.ConclusionCamptothecin and its derivatives can inhibit HepG2 cells and induce cell apoptosis.

Key words：Camptothecin; 10-hydroxy camptothecin; 7-ethyl camptothecin; 7-ethyl-10-hydroxy camptothecin; HepG2 cells