不同家族史鼻咽癌患者癌组织Prohibitin的表达*

陈舒华　刘丹　张继平　陈艳琼　张华宋，2　刘湘　黄泽棋



不同家族史鼻咽癌患者癌组织Prohibitin的表达*

陈舒华1刘丹1张继平1陈艳琼1张华宋1，2刘湘1黄泽棋1

目的 对比Prohibitin（PMB）在不同家族史的鼻咽癌患者癌组织中的表达，以探究鼻咽组织中Prohibitin是否可以作为鼻咽癌潜在标记物。方法 收集高癌家系气虚质鼻咽癌患者、鼻咽黏膜慢性炎症患者的鼻咽组织各9例，散发气虚质鼻咽癌患者的鼻咽组织12例，应用实时定量PCR方法检测Prohibitin在各组鼻咽组织中的表达。利用Western-blotting蛋白免疫印迹方法检测Prohibitin在各组患者鼻咽组织中的表达。结果 PHB mRNA在鼻咽黏膜慢性炎症鼻咽组织、散发气虚质鼻咽癌组织、高癌家系气虚质鼻咽癌组织中的2-△△Ct值分别为1.00±0.72、1.08±0.49、0.97±0.41（P＞0.05）。PHB蛋白相对表达依次为0.33± 0.21、0.59±0.25、1.72±0.96（P＜0.05）。分析 各组间对比PHB基因表达量无明显变化，但蛋白表达量鼻咽癌患者明显高于正常人，高癌家系鼻咽癌患者蛋白表达量高于散发患者，考虑与级联放大反应有关，有望成为高癌家系气虚质鼻咽癌患者早期诊断及筛查的标志物。

鼻咽癌高癌家系；Prohibitin；生物标志物；气虚体质

1广东佛山市第二人民医院耳鼻咽喉科（524028）

2广东医学院

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是主要来源于鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其死亡率在中国居头颈恶性肿瘤之首。高发区主要集中在中国南部，其中又以广东省最高发。与其他头颈肿瘤比较发现鼻咽癌与遗传等因素相关，表现出明显的家族聚集现象，鼻咽癌患者的一级亲属为患鼻咽癌的高危人群［1-7］。抗增殖蛋白（Prohibitin，PHB）广泛存在于各种生物细胞和组织中，是一组高度保守的蛋白，具有抗肿瘤增殖活性［8］，与一级亲属肿瘤患者具有密切相关性［9］。在本课题组前期［10］研究中证实鼻咽癌不同体质患者鼻咽癌组织中的PHB表达有所不一。由于蛋白组学技术存在本身的缺陷，需进一步明确PHB在高癌家系气虚质鼻咽癌患者中的表达差异及验证两者是否是前期利用蛋白组学技术鉴定出的结果。同时为鼻咽癌家族性提供分子水平的依据，以验证PHB是否能成为鼻咽癌高癌家系生物标记物。

资料与方法

1对象与分组

选取2013年7月～2014年10月在佛山市第二人民医院耳鼻咽喉科就诊的病例，其中高癌家系气虚质鼻咽癌患者、鼻咽黏膜慢性炎症患者的鼻咽组织各9例，散发气虚质鼻咽癌患者的鼻咽组织12例，本次实验所取的9例高癌家系气虚质鼻咽癌患者的鼻咽组织来自9个鼻咽癌高癌家系。高癌家系是指两代人中有3个以上成员确诊患癌症，其中二个以上为鼻咽癌。高癌家系气虚质鼻咽癌及散发气虚质鼻咽癌患者在取标本前均未接受过放化疗并均无淋巴结转移；根据“鼻咽癌2008分期”标准确诊；参照周小军“鼻咽癌家系体质调查研究”（中国中医基础医学杂志，2002年第11期）。

2材料

分别取鼻咽组织，-80℃保存。

3RT-PCR

逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）

3.1基因测序

分别取每个志愿者一管淋巴细胞，用RNesy Mini kit（50）分别提取细胞的基因总RNA，利用美国赛默飞世尔科技公司Nanodrop 2000分光光度计测定核酸浓度，OD值260/280在1.8～2.1范围内的用于下游实验。取2μg总RNA按照试剂盒进行逆转录cDNA。

3.2实时定量PCR

在Real Time PCR仪器上根据SYBR-Green半定量进行试验，每次试验重复至少3次。其反应体系如下（表1）：

表1　PCR反应液的配制

表2　PHB和β-actin引物序列

3.3实时定量数据处理

反应结束后，利用Real Time PCR仪Mx3005P软件对实验数据进行分析。相对定量实验使用的分析方法为比较Ct值法。根据公式：ΔCt实验组=Ct实验组目标基因-Ct实验组内参；ΔCt对照组=Ct对照组目标基因-Ct对照组内参；ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。此方法要求目的基因与内参基因的扩增效率大致相同。

4Western-blotting蛋白免疫印迹方法检测

取20mg组织，加入预冷的蛋白裂解液（每1ml RIPA加入10ulPMSF混合而成）250ul，冰上玻璃组织匀浆器匀浆，至均浆液透明无颗粒，将均浆液转移至预冷的1.5ml的EP管中，12000g离心3～5min，取上清液至新的预冷的1.5mlEP管，分装，-80℃保存。应用BCA方法进行蛋白定量，将蛋白样品（40μg）与加样缓冲液混合，100℃煮沸8min，微离心后用于SDS-PAGE凝胶电泳（10%）。电泳完毕后将胶上蛋白半干转至硝酸纤维素膜，膜于5%脱脂牛奶中室温封闭1h.加l：5000稀释的一抗（抗肌动蛋白抗体）室温孵育3h，加l：4000稀释的HRP标记的二抗室温孵育1h，加ECL反应4min，于暗房内压片，显影。

5统计学分析

用SPSS18.0软件处理检测数据。计量资料用均数±标准差（x¯±s）表示，数据符合正态分布，方差齐采用单因素方差分析及LSD检验。不齐则用Welch近似方差分析及Dunnett检验。当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

结果

1组间构成分析

鼻咽癌高癌家系气虚癌患者9例，男女比例=7: 2，年龄40.25±13.22岁，家族史回顾：其中一级亲属患鼻咽癌者7人，肝癌、食道癌各1人。

散发鼻咽癌患者12例，性别比=3∶1，年龄54± 13.84。

鼻咽黏膜慢性炎症患者9例，性别比2:1，年龄43±10.72岁。

2RT-PCR

逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）

实验一结果显示PHB基因在各组中的△Ct分别为6.21±0.80，6.00±0.68，6.13±0.58，2-△△Ct值分别为1.00±0.72，1.08±0.49，0.97±0.41（表3）；PHB基因在散发气虚质鼻咽癌组织、高癌家系气虚质鼻咽癌组织中的表达量分别为鼻咽黏膜慢性炎症鼻咽组织的1.16倍、1.06倍（图1）。PHB基因各组间表达均无统计学差异（P＞0.05）。

表3　炎症组、散发组、高癌家系组PHB mRNA的相对表达

图1　PHB mRNA在炎症组、散发组及高癌家系组中的相对表达

3Western-blotting蛋白免疫印迹方法

图2　PHB蛋白Western blotting蛋白免疫印迹结果图

Western blotting结果显示（图2），内参蛋白βactin在各组的鼻咽组织中表达量没有明显差异。而PHB与β-actin扫描的OD值比较（表4），在鼻咽黏膜慢性炎症鼻咽组织组、散发气虚质鼻咽癌组及高癌家系气虚质鼻咽癌组中依次为0.33±0.21、0.59± 0.25、1.72±0.96，三组间比较结果差异具有统计学意义（P＜0.05），组间两两多重比较结果（表4），在高癌家系气虚质鼻咽癌组及散发气虚质鼻咽癌组表达上调（图3）。

表4　三组间PHB蛋白相对表达量比较（x¯±s）

图3　PHB蛋白相对表达量直方图

讨论

鼻咽癌为我国高发肿瘤之一，其恶性程度较高。在世界范围内其分布具有明显区域性，在欧洲和美国发病率较低（0.5-2/100000），我国为世界鼻咽癌的高发地区之一，我国又以南方发病率为最高（25/100000），侨居世界各地的华人鼻咽癌发病率亦居较高水平。国内鼻咽癌分布同样具有明显的地区性差异，其中广东省中部的肇庆、佛山及广州为高发中心，向周围逐渐降低。与其他头颈肿瘤不同，鼻咽癌具有明显的遗传倾向性，其一级亲属是患鼻咽癌的高危人群。本研究追踪鼻咽癌高癌家系气虚癌患者9例，男女比例=7:2，年龄40.25±13.22岁，家族史回顾：其中一级亲属患鼻咽癌者7人，肝癌、食道癌各1人。散发鼻咽癌患者12例，性别比=3∶1，年龄54±13.84岁。鼻咽黏膜慢性炎症患者9例，性别比2∶1，年龄43±10.72岁。与此前调查结果符合，样本符合流行病学规律。

有学者研究揭示，气虚质是鼻咽癌的敏感体质，与鼻咽癌的发生发展有一定的关联性，而目前在高癌家系气虚质鼻咽癌研究领域国内外文献尚未见报道，近年来对PHB的研究表明，PHB与细胞的生长、分化、肿瘤的发生、发展及转移密切相关，具有重要的生理功能，在多种肿瘤中表达差异显著，PHB可能是癌基因产物，或受癌基因或抑癌基因调控，或通过某种途径激活癌基因。本课题组［11，12］通过2-DE对高癌家系癌患者癌组织的分析发现：在与散发鼻咽癌及正常人对比组中，均发现有表达差异蛋白质，其中囊括了PHB。然而仍需进一步验证蛋白及其表达的差异，所以PHB在鼻咽癌中的表达值得探究。

PHB与肿瘤的发生发展密切相关。PHB基因具有明显的抗细胞增殖、抗肿瘤作用，故被称为抗增殖蛋白。人类PHB基因家族包括PHB1、PHB2，分别定位于染色体17q21和染色体12p13。研究发现，PHB与乳腺癌易感基因（BRAC1）转座子邻近，意味着PHB与乳腺癌的发生密切相关［13］。不仅如此，E2F家族中5个成员在C端均有一个PHB结合位点，而E2F与细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生具有密切关系，PHB能够与E2F1及p53共定位于细胞核，从而使p53介导的转录活动增强，进而调节细胞周期［14］。此外，Ras是一个原癌基因，能够激活下游的一些信号通路发挥调节细胞增殖、迁移及侵袭的作用。Ras可以通过Ras/Raf-1/MAPK信号通路激活细胞的增殖与分化；也可以通过Ras/PI3K/Akt信号通路调节细胞的分化与迁移；还可以通过Ras/Ral-GEF/Ral信号通路将细胞增殖信号传递到细胞核内［15］。研究发现，PHB在Raf-1的激活中也发挥着重要作用，可以促进上述通路的激活，调节细胞的黏附及迁移［16］。

本次研究通过Real time PCR技术及Western blotting技术分别检测PHB mRNA及PHB蛋白在鼻咽黏膜慢性炎症鼻咽组织、散发气虚质鼻咽癌组织及高癌家系气虚质鼻咽癌组织中的表达量。Real time PCR结果显示结果显示PHB mRNA表达量在鼻咽黏膜慢性炎症鼻咽组织、散发气虚质鼻咽癌组织、高癌家系气虚质鼻咽癌组织中无差异，各组间比较差异均无统计学意义。Western blotting结果显示PHB蛋白相对表达量在鼻咽黏膜慢性炎症鼻咽组织、散发气虚质鼻咽癌组织、高癌家系气虚质鼻咽癌组织中有显著差异，各组间比较差异均具有统计学意义，在高癌家系气虚质鼻咽癌组织中PHB蛋白表达显著上调。PHB蛋白在高癌家系气虚质鼻咽癌组表达显著上调，与我们前期的蛋白质组学研究结果相符。本次研究发现，PHB在基因水平表达无差异，在蛋白水平表达有差异，我们推测PHB蛋白的翻译过程是否受到了某种因素的影响，导致PHB蛋白表达量增高。已有研究表明，mRNA表达水平和蛋白质表达水平并不存在着一对一的关联，两个表达水平之间存在显著的不平衡性［17］。蛋白质是基因的最终产物，也是基因功能的真正执行体，但是mRNA由于自身存在贮存、转运、降解、翻译调控及产物的翻译后加工，难以准确反映蛋白质的质和量。此外，蛋白质翻译后还存在化学修饰，比如磷酸化、糖基化等等，这些化学修饰也可以使蛋白分子的活性增高。Chiu CF等［18］发现，活化的Ras可以激活PI3K及Akt，磷酸化的Akt又可以相继激活PHB 及Raf-1；而磷酸化的PHB T258又可以反过来激活Ras下游的信号通路（即PI3K/Akt、Raf-1/MAPK）增强细胞的增殖、迁移及侵袭，这就是所谓的磷酸化级联现象。那么，我们的研究发现PHB在基因水平无差异，而在蛋白水平有差异，是否也是因为这种级联放大反应引起呢？这些都需要更进一步的实验探索和证明。但是，PHB蛋白在高癌家系气虚质鼻咽癌组表达显著上调，意味着检测癌症组织中PHB蛋白的表达情况可能对高癌家系气虚质鼻咽癌患者的早期预防和早期诊断具有重要意义，PHB有望成为高癌家系气虚质鼻咽癌患者早期筛查和早期诊断的分子标志物。

本研究存在着样本量较少、研究方法欠缺多样化等缺陷，今后将加大样本量，增加研究方式等进一步完善对PHB和鼻咽癌的探究。PHB可视为鼻咽癌早期诊断，高癌家系检测的指标之一，对进一步探究鼻咽癌的发生发展规律、早期诊断、及对气虚染毒理论提供实验依据。

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11陈舒华，陈学东，张继平，等.国家自然科学基金项目结题报告，2009.

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（收稿:2015-08-08修回：2016-04-01）

The expression of Prohibitin in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）in different family history

CHEN Shuhua，LIU Dan，ZHANG Jiping，CHEN Yanqiong，ZHANG Huasong，LIU Xiang，HUANG Zeqi The Second People's Hospital of Foshan，Guangdong，524028，China

Objective To observe whether Prohibitin（PHB）are differential expression protein in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）who are Qi-deficiency constitution in familial NPC.To test whether PHB are the key differentially expressed proteins which we have identified previously.Methods It had been collected of 9 cases with Qi deficiency of NPC from familial NPC，12 case with Qi deficiency of NPC from scattered distributed patients，at the same time collecting 9 cases nasopharyngeal tissue from chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa patients，to extract total RNA and protein respectively.The Real Time PCR technology was used to detect the expressions of PHB on the mRNA level and the Western blotting was used to detect the level of PHB.Results the In group of nasopharyngeal tissue from chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa patients，Qi deficiency of nasopharyngeal carcinoma from scatteredly distributed patients and high cancer families，PHB mRNA using Real Time PCR showed that 2-△△CT of RTPCR were respectively 1.00±0.72，1.08±0.49，0.97±0.41（P＞0.05），the PHB protein of Western blot were respectively 0.33± 0.21、0.59±0.25、1.72±0.96（P＜0.05）.Conclusions PHB mRNA relative have no obvious changes among three groups，but PHB expression quantity is significantly higher than nasopharyngeal mucosa patients in patients with NPC，and lower than familial NPC patients.It`s concern about PHB expression regulation the role in the Ras-driven activation of PI3K/Akt and Raf-1/ERK signaling cascades，PHB can be regarded as a biomarker of NPC.

familial nasopharyngeal carcinoma；Prohibitin；biomarker；Qi deficiency

陈舒华，主任医师.Email:cshua11@iCloud.com

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.02.002

*资金项目：国家自然科学基金项目（81173310，30572408），佛山市重点专科培育项目建设资助（Fspy2-2015008），佛山市创新型城市建设科技项目（2013AG10012）