水产品中呋喃唑酮代谢物检测结果不确定度的评定

马瑞欣　王晓静　周凡　王国辉

摘 要：采用液相色谱--串联质谱法检测水产品中呋喃唑酮代谢物的残留量。对影响检测结果的各分量不确定度进行了分析，最终得到检测结果在置信水平约95%、包含因子k=2时的扩展不确定度。结果表明，测量重复性和标准工作曲线是影响样品中AOZ残留量结果的主要因素。

关键词：呋喃唑酮代谢物（AOZ）；液相色谱——串联质谱法；不确定度

不确定度是指由于测量误差的存在，对被测量值不能肯定的程度。它是检测结果质量的指标。不确定度越小，检测结果与被测量的真值越接近，检测结果质量越高；不确定度越大，检测结果质量越低。JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》中测量不确定度的定义为：表征合理地赋予被测量之值的分散性，与检测结果相联系的参数[1]。《检验检测机构资质认定评审准则》4.5.15条规定“检验检测机构应根据需要建立和保持应用评定测量不确定度的程序”。

本文参考农业部783号公告-1-2006[2]检测方法，对呋喃唑酮代谢物（AOZ）残留量测定结果的不确定度来源进行了分析和评定，最终得到检测结果在置信水平约95%、包含因子k=2时的扩展不确定度。

1 方法原理及步骤

1.1 称量

称取样品2.0 g（精确到0.01 g）于离心管中。

1.2 水解和衍生化

加入100 μL内标溶液涡旋混匀50 s，再加入5 mL盐酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋振荡50 s，置于恒温水浴振荡器中37 ℃避光振荡16 h。

1.3 提取净化

取出离心管冷却至室温，加入3～5 mL 磷酸氢二钾溶液，调节pH=7.0～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，涡旋振荡50 s，离心，取上清液转移至10 mL离心管中；再加入4 mL乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于40 ℃下氮气吹干。准确加入1.0 mL水涡旋振荡溶解残渣，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 标准工作曲线制作

取10 ng/mL AOZ标准溶液0.025 mL、0050 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 于8个离心试管中，操作步骤同1.2和1.3。

1.5 定量测定结果

以AOZ定量离子响应面积As与内标定量离子响应面积Ai之比对浓度做工作曲线，曲线强制过原点。样品制备液中AOZ的浓度由仪器工作站按标准工作曲线给出。

1.6 样品中AOZ残留量按下式计算：

2 不确定度评定

2.1 影响检测结果的过程描述

2.1.1 AOZ标准储备溶液的配制 称取 10.0 mg AOZ，用甲醇定容至50 mL，浓度为200 μg/mL。AOZ纯度为 99.6±0.3%。所用仪器和器皿：十万分之一电子天平（两次称量相减）、50 mL容量瓶。

2.1.2 AOZ中间液的制备 取储备液50 μL用水稀释至100 mL，浓度为100 ng/mL，取5 mL该溶液，用水稀释至50 mL，浓度为10 ng/mL。所用仪器和器皿：100 μL移液枪、5 mL移液管、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶。

称取样品2.00 g，加入100 μL内标溶液。 所用仪器：百分之一电子天平（两次称量相减）、100 μL移液枪。

氮吹浓缩至干后用水定容至1.0 mL。所用仪器：1.0 mL移液枪。

标准工作曲线取8个点衍生同上，最后用水定容至1.0 mL，每个浓度点只进样一次，以AOZ定量离子响应面积As与内标定量离子面积Ai之比对浓度做工作曲线，曲线强制过原点。所用仪器：1.0 mL移液枪。

测定仪器：AB SCIEX QTRAP4500 液相色谱-串联质谱联用仪。

2.2 各分量标准不确定度的评定

2.2.1 检测重复性标准不确定度u1

独立检测3份样品，所得结果为：2.24 μg/kg，2.28 μg/kg，2.44 μg/kg，平均值为2.32 μg/kg。

单次检测的实验标准差计算公式为：

日常分析中，检测两份平行样品，报告平均值。两次检测结果平均值的相对标准不确定度为：

u1rel=S（X）2X=0.1061.414×2.32=0.032 3

此分量（A类不确定度）综合体现了检测方法、测定仪器、体积与质量测量中各个方面的随机效应。因此，在随后评定其他分量时不需要再考虑随机效应了。

2.2.2 ci的不确定度u2

2.2.2.1 标准工作曲线拟合引入的标准不确定度u2（1）

因强制过原点，标准曲线9个点，结果见表1：

标准工作曲线一次性方程为： y=0·121 63x，r=0.999 39

标准工作曲线拟合引入的不确定度计算公式[3]为：

u2（1）=S（cp）=S（f）b1p+1n+（f-f）2b2∑ni=1（Ci-C）2

式中：p—样品平行测定的次数；n—拟合直线的点数；b—拟合直线的斜率，b=0.121 63；

cp—试样测试值；c—绘制拟合直线输入值Ci（n个）的平均值。

本实验中：n=9 ， p=2，2个平行样品中AOZ定量离子面积分别为y1=155 019，y2=147 926；内标定量离子面积分别为y内1=537 903，y内2=539 252。f1=155 019537 903=0.288 2，f2=147 926539 252=0.274 3，标准偏差s（f）=0.009 829。利用拟合直线得到2个平行样品上机溶液的对应浓度为2.369 ng/mL和2.255 ng/mL，平均值2312 ng/mL，樣品上机溶液的浓度通过拟合标准工作曲线确定，由标准工作曲线拟合引入的不确定度为：

2.2.2.2 内标体积的标准不确定度u2（2）

查检定证书得知：100 μL移液枪在100 μL检定点的误差为2.0 μL，区间半宽度为1.0 μL，服从三角分布，包含因子k=6，其标准不确定度为：1.0 μL/k=6=0.41 μL。实验在20 ℃下进行，实验室温度介于±5 ℃之间，水的体积膨胀系数为 2.07×10-3 / ℃，服从均匀分布，区间半宽度为 5 ℃×2.07×10-3 ℃-1=1.04×10-2，包含因子k=3，由温度变动引入的标准不确定度为1.04×10 合成标准不确定度为u2（2）=0.412+0.00 602=0.41（μL）

相对合成标准不确定度为：u2（2）rel=0.41100=0004 1

样品制备液中AOZ浓度的相对不确定度是上述分量的合并，即：

u2rel=u22（1）rel+u22（2）rel =0.028 02+0.004 12=0.028 3

2.2.3 AOZ标准溶液浓度的标准不确定度u3

2.2.3.1 AOZ储备溶液浓度的标准不确定度

a.AOZ质量的标准不确定度u3（1）

十万分之一电子天平的最大允差为±0.01 mg，服从均匀分布，区间半宽度为0.01 mg，由此项引入的不确定度为0.01 mg/3=0.005 77 mg

天平分辨力为0.01 mg， 服从均匀分布，区间半宽度为0.005 mg，引入的标准不确定度为0005 mg/3=0.002 89 mg

合成标准不确定度u（m）=0.005 772+0.002 892=0.006 45（mg）；标准物质10.0 mg是通过两次称量相减得到，故u3（1）rel=2×0.006 4510.00=0.000 912

b.50 mL容量瓶体积的标准不确定度u3（2）

50 mL A级容量瓶在20 ℃的体积为50 mL±0.05 mL，假设为三角分布，区间半宽度0.05 mL，由此项引入的标准不确定度为0.05 mL/6=0.020 4 mL

容量瓶在20 ℃校准，实验室温度在（20±5） ℃之间，液体的膨胀体积明显大于容量瓶的体积膨胀，因此只需考虑液体体积膨胀。甲醇的膨胀系数为0.001 20 ℃-1，由此项引入的标准不确定度为5×0.001 203=0.03 46（mL）

合成标准不确定度为：u3（2）=0.020 42+0.003 462=0.020 7（mL），相对合成标准不确定度为：u3（2）rel=0.020 7/50=0000 414

c.AOZ纯度的标准不确定度u3（3）

AOZ纯度 99.6±0.3%，区间半宽度为03%，服从正态分布，包含因子k=1.96，由此项引入的不确定度u3（2）rel=0.003/1.96=0.001 5，相对标准不确定度为：u3（2）rel=0.001 5/0.996=0.001 5

2.2.3.2 中间稀释液引入的标准不确定度

a.移液枪引入的体积标准不确定度u3（4）

100 μL移液枪在50 μL检定点的误差为1.5 μL，区间半宽度为0.75 μL，假设为三角分布，包含因子k=6。因此，其标准不确定度为0.75 μL/6=0.306 μL。

甲醇的膨胀系数为0.001 20 ℃-1，由此项引入的标准不确定度为：5×0.001 203=0.003 46（μL）

合成标准不确定度为u3（4）=0.3062+0.003 462=0.306（μL），相对合成标准不确定度為u3（4）rel=0.306/50=0.006 12

b.50 mL容量瓶引入的体积标准不确定度u3（5）

50 mL A级容量瓶在20 ℃的体积为50 mL±0.05 mL，假设为三角分布，区间半宽度0.05 mL，由此项引入的标准不确定度为0.02 mL/6=0.020 4 mL

由2.2.2.2知因水的体积受温度的变动引入的标准不确定度为 0.006 0 mL。

合成标准不确定度为：u3（5）=0.02 042+0.006 002=0.021 3（mL），相对合成标准不确定度为：u3（5）=0.021 3/50=0000 426

c.吸量管引入的体积标准不确定度u3（6）

据JJG196-2006中规定，5 mLA级分度吸量管的允差为±0.025 mL，符合三角分布，区间半宽度为0.025 mL，由此项引入的标准不确定度0.025 mL/6=0.010 2 mL

由2.2.2.2知因水的体积受温度的变动引入的标准不确定度为 0.006 0 mL。

合成标准不确定度u3（6）=0.010 22+0.006 002=0.011 8（mL），相对合成标准不确定度为：u3（6）rel=0.011 8/5.00=0002 36

d.100 mL容量瓶引入的体积标准不确定度u3（7）

100 mL A级容量瓶的允差为±0.10 mL，假设为三角分布，区间半宽度为0.10 mL，由此项引入的标准不确定度为0.10 mL/6=0.040 8 mL

由2.2.2.2知因水的体积受温度的变动引入的标准不确定度为0.006 0 mL。合成标准不确定度u3（7）=0.040 82+0.006 02=0.041 2（mL），相对合成不确定度为：u3（7）rel=0.041 因此标准溶液在配制和稀释过程中引入的相对合成标准不确定度为 ：

2.2.4 试样质量m称量的标准不确定度u4

天平检定合格，天平说明书中标明允差为±0.01 g，服从均匀分布，区间半宽度为0.01 g，包含因子k=3，其标准不确定度为0.01 g/3=005 8 g

天平说明书中标明其分辨力为0.01 g，服从均匀分布，区间半宽度为0.005 g， 包含因子k=3，其标准不确定度为0.00 5 g/3=0.002 9 g

m称量的合成标准不确定度u4=0.005 82+0.002 92=0.006 48 g

称取样品2.00 g，通过2次称量相减获得，m的相对合成标准不确定度为：

2.2.5 试样体积V的标准不确定度u5

检定证书上1 mL移液枪的误差为0.001 mL，区间半宽度为0.000 5 mL，服从三角分布，包含因子k=6，因此，其标准不确定度为0.000 5 mL/6=0.000 204 mL

由2.2.2.2知因水的体积受温度的变动引入的标准不确定度为0.006 0 mL。

试样体积V的合成标准不确定度为：u5=0.000 2042+0.006 02=0.006 01（mL）

定容体积为1.000 mL，试样体积V的相对合成标准不确定度为u3rel=0.006 011.000=0.006 00

2.2.6 回收率引入的标准不确定度u6

取9份空白样品2.00 g ，分别加入4.00 ng标准溶液，加标量为2.00 μg/kg，按上述方法测定，测定结果见表2。

回收率的平均值R=19∑9i=1Ri=100，标准偏差SR=∑9i=1（R-R）n-1=3.23，回收率的相对不确定度u6rel=SRRn=3.23100×9 =0.010 7

采用t检验法对回收率进行显著性检验，t=100-Ru（R）=100-1003.23/9=0，查表t0.95（8）=231，t

2.3 计算AOZ检测结果的不确定度

2.3.1 合成相对标准不确定度

2.3.2 扩展不确定度 合成标准不确定度u（X）=1.16 μg/kg×0.045 4=0.052 7 μg/kg。95%概率下取包含因子k=2，則扩展不确定度为U=2×0.052 7 μg/kg=0.11 μg/kg。

2.3.3 检测结果表示 样品中AOZ残留量的结果表示为（1.16±0.11） μg/kg，k=2。

3 结论

通过对各分量不确定度的评估可以看出：测量重复性不确定度和工作曲线引入的不确定度是影响样品中AOZ残留量检测结果不确定度的主要因素。提高检测结果的准确性可以通过优化稳定仪器工作状态和准确配制标准系列来实现。本评定报告可对提高检测结果准确度起到指导作用。

参考文献：

[1]

国家质量监督检验检疫总局.JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S].中国标准出版社，2013

[2] 中华人民共和国农业部.农业部783号公告-1-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[S].中国农业出版社出版，2006

[3] 周尊英，刘心同，实验室质量管理统计技术[M].北京：中国标准出版社，2014：256.

（收稿日期：2016-11-21）