脂质体和厚朴酚联合热疗对腺样囊性癌增殖的协同抑制作用

王冠杰 ，赵娅娟 ，董济民

(西安市中心医院,a肿瘤科，b体检中心；陕西 西安　710004)



◇药学研究◇

脂质体和厚朴酚联合热疗对腺样囊性癌增殖的协同抑制作用

王冠杰a，赵娅娟b，董济民a

(西安市中心医院,a肿瘤科，b体检中心；陕西 西安710004)

摘要：目的探讨脂质体和厚朴酚联合热疗对人腺样囊性癌肿瘤模型的增殖抑制作用。方法用DOTAP:Chol脂质体包裹和厚朴酚来进行抗肿瘤体内实验；构建小鼠人腺样囊性癌肿瘤模型，瘤内注射和厚朴酚并联合局部热疗，观察肿瘤大小及小鼠生存期及生长状态，对移植瘤进行CD31免疫组化染色和TUNEL分析。结果脂质体和厚朴酚联合热疗的抗肿瘤效应更强，联合治疗组肿瘤的体积明显小于对照组、热疗组、和厚朴酚组(P<0.05)，部分肿瘤完全消退。联合治疗组小鼠的生存期有明显获益(P<0.05)，在残存肿瘤中，肿瘤组织内微血管密度低于其他组，凋亡细胞明显增多。 结论脂质体和厚朴酚能明显抑制人腺样囊性癌增殖，与热疗联合能够增强诱导肿瘤细胞凋亡，产生更强肿瘤杀伤效应。

关键词：囊腺癌；高温,诱发；脂质体；厚朴酚；细胞凋亡

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC) 是泪腺上皮性肿瘤中最为常见并且恶性程度最高的肿瘤，其发生率居于第 2 位，仅次于多形性腺瘤。具有极强的侵袭性，早期即可侵犯血管和神经，而且还易发生远处转移，以肺转移最为常见， 转移率高达40%。目前临床对于ACC的治疗主要采取手术联合放疗，但远期疗效仍不甚理想[1]。和厚朴酚(Honokiol，HNK)是从木兰科木兰属植物厚朴的根皮和枝皮中提取的小分子化合物。有研究表明其具有抗炎[2]、抗血栓[3]、抗氧化[4]、抑制细胞增殖、诱导细胞毒作用[5]等作用。其中一种机制为和厚朴酚还可以通过诱导细胞产生活性氧自由基(ROS)，激活细胞内MAPK信号通路，上调表达蛋白JNK、P38、ERK( P42/P44)水平以促进肿瘤细胞的凋亡[4]，同时和厚朴酚促使细胞停滞在G1期并诱导细胞凋亡[5]。然而和厚朴酚的水溶性极低，正常给药后血药浓度很低，从而限制了它的临床应用。在本课题组前期研究中，我们制备得到PEG-PE修饰的脂质体和厚朴酚。实验证明，PEG-PE修饰的脂质体和厚朴酚显著改善了和厚朴酚的溶解性和在血浆中的药物浓度，延长了它的半衰期[6]。本研究旨在观察脂质体和厚朴酚对小鼠腺样囊性移植瘤的治疗作用及其联合热疗的疗效。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器和厚朴酚(HNK 99．99%纯度)购自上海纯优生物科技有限公司，二甲基亚砜 (DMSO)购自Sigma公司，PEG-PE修饰的脂质体由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室合成；胎牛血清、RPMI-1640 培养基、胰蛋白酶均购自杭州四季青公司。大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体：购自BD Pharmingen公司;原位TUNEL检测试剂盒：购自Promega公司；荧光倒置显微镜(Nikon TI-S)为日本尼康公司。腺样囊性癌 ACC-2 细胞株购自中科院上海细胞所，BALB/c小鼠购自南京君科生物工程有限公司，动物使用许可证号WCCSIB-D-2011-029。

1.2细胞培养与动物肿瘤模型的建立腺样囊性癌 ACC-2 细胞株用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)于37℃，5% CO2条件下传代培养。动物模型参考文献建立[7]。采用6～8周龄、20 g左右的BALB/c雌性小鼠,SPF级动物房饲养，将ACC-2细胞接种到小鼠右后肢外侧皮下，每只接种5×105～1×106个细胞(0.1 mL)。

1.3实验动物分组及处理将小鼠随机分为对照组、热疗组、和厚朴酚组、和厚朴酚+热疗组，每组10只，采用尾静脉注射给药的方式在每4天治疗一次，生理盐水、脂质体和厚朴酚分别为100 μL、50 μg。局部水浴热疗42℃，每天1 h。疗程结束后处死小鼠后取肿瘤组织，固定、切片，按TUNEL试剂盒说明书操作染色，荧光显微镜下观察。

2　结果

2.1荷瘤小鼠移植瘤生长情况及瘤体的变化趋势

将ACC-2细胞接种到小鼠右后肢外侧皮下，每只接种1×106个细胞(0.1 mL)，肿瘤体积测定按照Steel经验公式：肿瘤体积(mm3) = π/6 × 长 × 宽2，长：肿瘤最长径，宽：肿瘤最短经。当肿瘤体积达到 200 mm3时，开始给药。开始治疗1月后，联合治疗组肿瘤生长最缓慢，甚至有1只小鼠肿瘤完全消退。从图中可以看出单药和厚朴酚或局部热疗可以抑制肿瘤生长，但联合治疗可以发挥更强的作用(图1)，进一步进行两因素重复测量方差分析发现： 4个治疗组间(F分组，P分别为：25.68，0.000)、各时点间(F时间，P分别为：554.21，0.000)、组和时间的交互作用(F交互，P分别为：60.77 0.000)均有统计学意义(P<0.05)，提示肿瘤体积在组间、时点间的变化很大，且随时间的变化趋势受分组影响。热疗组对比HNK组，差异无统计学意义，其余组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1　移植瘤生长情况及肿瘤体积的变化趋势

2.2荷瘤小鼠不同治疗的生存时间比较在腺样囊性癌 ACC-2小鼠肿瘤模型中，联合治疗小鼠有明显生存获益，联合治疗组中位生存期达42.3 d，而生理盐水组为14.5 d，热疗组为36.6 d，厚朴酚组均为37.9 d。Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验发现，联合治疗组的生存期明显优于其他三组，差异有统计学意义(χ2=27.90 ，P<0.05)(图2)。

图2　荷瘤小鼠不同治疗后生存时间比较

2.3不良反应观察随着肿瘤逐渐增大及化疗药物使用，各组荷瘤鼠摄食均出现减少，活动逐渐迟缓，精神状态变差，体质量减轻。后期出现肿瘤恶病质表现，甚至死亡。处死小鼠后取重要脏器进行大体及显微镜下观察，联合治疗组与对照组均未见发现明显的异常(图3)。

图3　荷瘤小鼠重要脏器HE染色(×200)

2.4免疫组化染色检测肿瘤组织内微血管密度取肿瘤组织石蜡切片，采用CD31单抗做肿瘤组织血管内皮细胞免疫组化染色后显微镜下观察(图4)，200倍光镜下，每组切片拍摄5个阳性视野，每个视野计数微血管数，计算平均微血管数作为肿瘤组织内微血管密度(MVD)，各组微血管密度分别为生理盐水对照组 26.7%±5.5%、热疗组18.3%±4.6%、和厚朴酚组24.6%±6.5% 、联合治疗组13.5%±4.7% 。联合治疗组肿瘤组织内微血管密度显著低于其他三组(F=5.63，P<0.05)。(图5)。

注：A.对照组 B.热疗组 C.HNK组 D.热疗+HNK组

图4移植瘤CD31免疫组化染色(×200)

图5　各组荷瘤小鼠移植瘤组织内微血管密度(n=5)

2.5原位细胞凋亡检测(TUNEL)移植瘤内肿瘤细胞凋亡数取肿瘤组织石蜡切片，用原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒染色后荧光显微镜下观察(图6)，每组切片拍摄6个阳性视野，每个视野计数200个细胞，计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。各组凋亡指数分别为生理盐水组 6.7%±0.5%、热疗组38.3%±0.6%、和厚朴酚组34.8%±0.5%、联合治疗组55.6%±4.8%。联合治疗组肿瘤凋亡指数显著高于其他三组(F=251.57，P<0.05)。见图7。

注：A.对照组 B.热疗组 C.HNK组 D.热疗+HNK组

图6移植瘤原位细胞凋亡检测(TUNEL染色) (×200)

图7　各组荷瘤小鼠肿瘤凋亡指数(n=6)

3　讨论

腺样囊性癌是一种少见的肿瘤类型，多发生于头颈部，尤其是涎腺区，也有发生于乳腺、泪腺、支气管的报导。腺样囊性癌是涎腺第三大常见肿瘤，治疗首选根治性手术切除，然而头颈部解剖结构复杂，且肿瘤极易延神经蔓延，导致手术难以根治，术后常需进行辅助放疗，化疗疗效有限，仅用于晚期远处转移的患者，因此亟需开发更为有效的治疗性药物。

和厚朴酚是天然植物厚朴的皮中提取的一种化合物，气味辛香，具有独特的物理特性，能够穿过血脑屏障，中医认为其具有化湿导滞的作用。有研究表明，和厚朴酚还具有抗癌作用，可体外诱导结黑色素瘤、骨肉瘤、肠癌和肝癌等肿瘤细胞凋亡[8-11]。和厚朴酚可抑制Akt磷酸化，调节核生长因子NF-кB激活，进一步调控VEGF、MCL1、COX-2等蛋白，从而诱导凋亡[12]。另外，和厚朴酚还能诱导caspase介导的凋亡途径[13]，在p53缺失时，和厚朴酚通过激活caspas3、7、9而激活外源性凋亡途径，p53存在时，还可通过内源性途径启动凋亡程序，这一途径在各肿瘤细胞系中更为常见和广泛。

热疗是继手术、放疗、化疗及生物治疗后又一肿瘤治疗手段，由于其不良反应小，已经被越来越多的临床工作者所重视[14-15]。不少国内外相关文献对其机制进行了研究与阐明，文献显示热疗能够诱导肿瘤细胞凋亡[15]增加肿瘤细胞对放化疗敏感性[16]减轻患者的放化疗期间不良反应[17]。热疗还能使细胞VEGF 的表达受抑制，从而抑制肿瘤生长及转移。肿瘤细胞经过高温作用后可产生热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)其能够激活机体的免疫功能， 产生针对自身肿瘤细胞的细胞因子[16]。

在我们的研究中，单药脂质体和厚朴酚或单纯热疗均能产生抗肿瘤效应，然而联合治疗组肿瘤生长更慢，小鼠生存期更长，肿瘤组织内微血管密度更低，TUNEL染色可见更多凋亡细胞。目前热疗已广泛用于临床，具有很好的疗效，体外研究证明热疗具有促进药物进入肿瘤细胞和诱导的凋亡的作用，而和厚朴酚可诱导Caspase介导的凋亡途径[18]。热疗增加脂质体和厚朴酚的抗肿瘤作用，其具体机制可能是：两种治疗从不同位点激活Caspase途径，产生协同作用从而促进细胞凋亡，但真实的内在机制仍需进一步研究。

综上所述，脂质体和厚朴酚联合热疗治疗腺样囊性癌 ACC-2荷瘤小鼠，具有好的近期疗效和远期生存，且无明显不良反应。热疗能协同脂质体和厚朴酚诱导促进肿瘤凋亡，其内在机制仍需进一步研究，但可以预期，联合治疗具有广泛的临床应用前景。

参考文献

[1]North JP,McCalmont TH,Fehr A.Detection of MYB alterations and other immunohistochemical markers in primary cutaneous adenoid cystic carcinoma[J].Am J Surg Pathol,2015,39(10):1347-1356.

[2]Wang Y,Zhang ZZ,Wang YL,et al.Honokiol protects rat hearts against myocardial ischemia reperfusion injury by reducing oxidative stress and inflammation[J].Exp Ther Med,2013,5(1):315-319.

[3]Ponnaluri VK,Vavilala DT,Mukherji M.Hypoxia mediated expression of stem cell markers in VHL-associated hemangioblastomas [J].Biochem Biophys Res Commun,2013,438(1):71-77.

[4]Suh KS,Chon S,Choi EM.Protective effects of honokiol against methylglyoxal-induced osteoblast damage[J].Chem Biol Interact,2016,244(1):169-177.

[5]Guo YB,Bao XJ,Liu HY,et al.Honokiol induces cell cycle arrest and apoptosis via p53 activation in H4 human neuroglioma cells[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(5):7168-7175.

[6]Yu DD,Wang CT,Wei YQ,et al.Enhancement of cisplatin sensitivity in Lewis Lung carcinoma by liposome-mediated delivery of a survivin mutant.[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:46-53.

[7]Sun L,Liu B,Lin Z,et al.MiR-320a acts as a prognostic factor and Inhibits metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma by targeting ITGB3[J].Mol Cancer,2015,14:96-109.

[8]Bernaskova M,Kretschmer N,Schuehly W.Synthesis of tetrahydrohonokiol derivates and their evaluation for cytotoxic activity against CCRF-CEM leukemia,U251 glioblastoma and HCT-116 colon cancer cells[J].Molecules,2014,19(1):1223-1237.

[9]Ponnurangam S,Mammen JM,Ramalingam S.Honokiol in combination with radiation targets notch signaling to inhibit colon cancer stem cells[J].Mol Cancer Ther,2012,11(4):963-972.

[10] Rajendran P,Li F,Shanmugam MK,et al .Honokiol inhibits signal transducer and activator of transcription-3 signaling,proliferation,and survival of hepatocellular carcinoma cells via the protein tyrosine phosphatase SHP-1[J].J Cell Physiol,2012,227(5):2184-2195.

[11] Banerjee P,Basu A,Arbiser JL,et al.The natural product honokiol inhibits calcineurin inhibitor-induced and Ras-mediated tumor promoting pathways[J].Cancer Lett,2013,338(2):292-299 .

[12] Lv X,Liu F,Shang Y,Chen SZ.Honokiol exhibits enhanced antitumor effects with chloroquine by inducing cell death and inhibiting autophagy in human non-small cell lung cancer cells[J].Oncol Rep,2015,34(3):1289-1300.

[13] Yan B,Peng ZY.Honokiol induces cell cycle arrest and apoptosis in human gastric carcinoma MGC-803 cell line[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(4):5454-5461.

[14] Ahmed K,Tabuchi Y,Kondo T.Hyperthermia:an effective strategy to induce apoptosis in cancer cells[J].Apoptosis,2015,20(11):1411-1419.

[15] 王济东,夏廷毅,焦宝云，等.螺旋断层放疗联合热疗治疗局部晚期肿瘤或寡转移的疗效观察[J].山西医科大学学报，2015，46(10):1030-1032.

[16] Oei AL,van Leeuwen CM,Franken NA,et al.Hyperthermia selectively targets human papillomavirus in cervical tumors via p53-dependent apoptosis[J].Cancer Res,2015,75(23):5120-5129.

[17] Lai YJ,Lin CI,Wang CL.Expression of survivin and p53 modulates honokiol-induced apoptosis in colorectal cancer cells[J].J Cell Biochem,2014,115(11):1888-1899.

[18] Shetake NG,Kumar A,Pandey BN,et al．Magnetic nanoparticle-mediated hyperthermia therapy induces tumour growth inhibition by apoptosis and Hsp90/AKT modulation [J].Int J Hyperthermia,2015,31(8):909-919.

基金项目：国家自然科学基金(81172589)

通信作者：董济民，男，主任医师，研究方向：实体肿瘤内科综合治疗，E-mail：1065048045@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.004

(收稿日期：2016-02-27，修回日期：2016-05-09)

Synergistic antitumor effects of liposomal honokiol combined with hyperthermia in adenoid cystic carcinoma models

WANG Guanjiea,ZHAO Yajuanb,DONG Jimina

(a.DepartmentofOncology;b.ExaminationCenter,Xi’anCentralHospital，Xi’an，Shannxi710004,China)

Abstract:ObjectiveTo assess the inhibitory effects of liposomal honokiol on proliferation in human adenoid cystic carcinoma in vivo.MethodsDOTAP-embedded honokiol was adopted and injected in animal tumor models of adenoid cystic carcinoma(ACC-2cells)cells.The mice were treated with 0.9% saline,local thermotherapy,lipo-honokiol,and lipo-honokiol plus thermotherapy respectively.Tumor size,suvival time,adverse events were observed.Histological analyses of tumors were taken.ResultsWe found that lipo-honokiol plus thermotherapy increased the apoptotic tumor cells dramatically with smallest mean tumor volumes，microvessel density and survival time.ConclusionsThis study suggests that lipo-honokiol may suppress the proliferation of adenoid cystic carcinoma cells.The combined treatment of lipo-honokiol plus thermotherapy may enhance the apoptosis process in adenoid cystic carcinoma(ACC-2cells)cells.

Key words：Cystadenocarcinoma；Hyperthermia,Induced；Liposomes；MAGNOLOL；Apoptosis