激活VEGF-C/VEGFR-3信号通路调控淋巴管生成对慢性结肠炎的影响

赵　静　王晓蕾



激活VEGF-C/VEGFR-3信号通路调控淋巴管生成对慢性结肠炎的影响

赵静王晓蕾

200065上海，同济大学附属同济医院消化内科

炎症性肠病(IBD)是一组病因及发病机制尚未明确的慢性非特异性肠道炎性疾病，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。近年来研究表明，IBD的发病及病情迁延与淋巴管生成有关。早在20世纪初期就有大量报道指出CD患者的病变肠道中可见淋巴管阻塞、组织水肿等表现，表明慢性淋巴管炎的存在。但目前关于淋巴管与IBD的病情进展与维持的关系研究并不多。肿瘤、皮肤慢性炎性反应实验研究显示，淋巴管特异性血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)可经血管内皮生长因子-C(VEGF-C)激活，促进淋巴管内皮细胞增殖、迁移和淋巴管新生，在肿瘤淋巴结转移、促进炎症引流方面有一定作用。因此，本研究将以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠慢性结肠炎模型为研究对象，通过高表达VEGF-C激活VEGFR-3信号通路，检测小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理学评分、淋巴管密度(LVD)及管径大小的变化，探讨淋巴管生成对慢性结肠炎的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

8～10周龄健康雌性C57BL/6小鼠25只，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，饲养于上海市同济医院SPF级动物实验室，温度维持在20℃～24℃，相对湿度维持在40%～70%，12 h光照再12 h黑暗。

1.2慢性结肠炎模型制备及实验设计

以无菌纯水配制的2% DSS溶液饲喂小鼠5 d后更换为无菌纯水饲喂5 d，此作为一个循环，重复饲喂3个循环建立慢性结肠炎模型。正常组(5只)小鼠不进行处理；DSS模型组(10只)小鼠依上述方法诱导慢性结肠炎模型；高表达VEGF-C腺病毒(Ad-VEGF-C-EGFP)刺激组(10只)小鼠建立慢性结肠炎模型，且于每个循环结束时尾静脉注射Ad-VEGF-C-EGFP(5×108～5×109pfu/mL) 100 μL。3个循环结束后第7 天处死小鼠，留取全结肠标本。所有小鼠均自由取食灭菌饲料，DSS溶液隔天更换。

1.3Ad-VEGF-C-EGFP构建及主要试剂

1.4DAI监测

在建模过程中，隔日观察并记录小鼠的体质量、粪便性状、肠道出血情况这3个指标，计算小鼠DAI得分，间接评价结肠炎性反应的严重程度。DAI评分标准如下：体质量减轻程度(无减轻为0分，1%～5%为1分，5%～10%为2分，10%～20%为3分，>20%为4分)，粪便性状(正常为0分，松散粪便为2分，腹泻为4分)，肠道出血情况(无出血为0分，粪便隐血为2分，肉眼血便为4分)；DAI得分即为上述指标总和[1]。

1.5组织病理学评分

取远端结肠组织(0.5 cm)于4%甲醛溶液中固定，常规处理切片后经苏木精-伊红(HE)染色，观察结肠组织炎性反应的严重程度。组织病理学评分标准如下：隐窝结构(正常为0分，严重的隐窝变形为3分)，炎性细胞浸润程度(正常为0分，稠密的炎性细胞浸润为3分)，肌层增厚情况(隐窝基底位于黏膜肌层上为0分，肌层显著增厚为3分)，杯状细胞损失(无为0分，有为1分)，隐窝脓肿(无为0分，有为1分)；组织病理学得分即为上述指标总和。

1.6结肠LYVE-1免疫组织化学染色及结果评估

标本取自远端结肠组织，切片(4 μm)常规脱蜡，置柠檬酸钠溶液中微波炉加热进行抗原修复，切片经3%牛血清蛋白室温封闭后，依次孵育兔抗鼠LYVE-1多克隆抗体(1∶200)及酶标山羊抗兔二抗。经DAB显色后，常规脱水、透明、封片。LYVE-1表达阳性的管腔即为淋巴管[2-3]。光学显微镜(×100)下观察LYVE-1阳性管腔。每张片子选取5处淋巴管高密度区，计数该区域LYVE-1阳性管腔数，取平均值即为LVD，同时测量淋巴管的管径大小(取长径)，比较各组间LVD及管腔扩张。

1.7统计学方法

采用统计学软件SPSS20.0进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。数据图片由GraphPad Prism 5.0处理生成。P<0.05表示差异有统计学意义。

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2结果

2.1体外VEGF-C表达

以Ad-VEGF-C-EGFP及Ad-EGFP转染人胚肾293细胞，RT-qPCR检测体外VEGF-C表达。结果显示，与Ad-EGFP感染细胞、未感染细胞相比较，Ad-VEGF-C-EGFP感染293细胞中VEGF-C蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2小鼠DAI的变化

统计分析显示，与正常组(0.03±0.02)相比较，VEGF-C组小鼠(1.94±0.15)、DSS组(2.52±0.21)的DAI明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；VEGF-C组小鼠DAI相较于DSS组明显下降，尤其在实验第9天、第15天、第27天的差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3结肠组织病理学评分

光镜下每张HE染色片子随机选取3个视野，依据上述评分标准进行评分，取平均值作为该结肠组织的病理学得分。光镜下可见DSS组、VEGF-C组结肠均出现隐窝结构变形紊乱、炎性细胞浸润、杯状细胞缺失、黏膜下水肿改变(见图1)。统计分析显示，与正常组(0.67±0.58)相比较，DSS组(7.67±0.58)、VEGF-C组(4±0.71)的组织损伤较明显，差异均有统计学意义(P<0.01)。与VEGF-C组相比较，DSS组的组织病理学得分更高(P<0.01)。

图1结肠HE染色及组织病理学得分ADSS组(×100)BVEGF-C组(×200)C各组结肠组织病理学得分

2.4结肠淋巴管数量及分布情况

光镜下免疫组织化学切片显示，与正常组相比较，DSS组与VEGF-C组的LVD有所增加，且VEGF-C组结肠淋巴管的管腔扩张更明显(见图2)。统计分析显示，与正常组(16.73±2.52)相比较，DSS组(19.67±1.67)、VEGF-C组(20.43±3.47)小鼠结肠LVD变化的差异无统计学意义(P>0.05)。淋巴管管径分析显示，与正常组(102.65±21.00)相比，DSS组(166.06±10.16)、VEGF-C组(196.97±7.08)淋巴管的管径明显扩张，差异均有统计学意义(P<0.05)，VEGF-C组小鼠淋巴管扩张相较于DSS组更显著(P<0.05)。

图2结肠LYVE-1免疫组织化学染色及淋巴管情况A正常组(×200)BDSS组(×200)CVEGF-C组(×200)D各组结肠LVD检测E各组结肠淋巴管管径测量

3讨论

生理状态下，淋巴管系统具有维持组织间质液体平衡、调节免疫反应、引流白细胞和清除细菌等重要功能。淋巴管积极参与了慢性炎性反应。尽管淋巴管在IBD发病及疾病维持中的作用尚无定论，但是IBD患者的结肠组织一直存在淋巴管阻塞、功能失调等现象[4-5]。有研究指出，IBD中的淋巴管生成是炎性反应早期机体的一种代偿反应，可减轻组织水肿、缓解炎性反应。随着炎性反应的进展，组织水肿加重，淋巴管炎出现，淋巴管引流白细胞和液体的功能障碍，导致局部炎性反应加重并持续[3,6-7]。目前已有研究表明，IBD患者、小鼠慢性结肠炎模型中炎性结肠组织淋巴管数量明显增加[1,6-7]。

VEGFR-3(又称Flt4)是较早被识别的淋巴管特异性生长因子受体[8]，可特异性结合VEGF-C、VEGF-D配体后被激活，促进淋巴管内皮细胞增殖、迁移和淋巴管新生。Tammela等[9]研究显示，通过高表达VEGF-C激活VEGFR-3通路，可使小鼠集合淋巴管向淋巴结引流功能恢复。在小鼠慢性关节炎中，经高表达VEGF-C病毒处理后的小鼠，其关节积液量明显减少、炎性反应好转，同时关节组织中淋巴管生成增多、管径扩张、局部淋巴管引流功能增加[10]。特异性抗体阻断VEGFR-3通路可见组织中淋巴管生成减少，淋巴管引流功能下降，组织炎性反应加重[2,11-12]。由此可见，VEGF-C/VEGFR-3信号通路可通过调控淋巴管生成、增强淋巴管引流功能来控制慢性炎性反应。

本研究通过高表达VEGF-C腺病毒对小鼠慢性结肠炎进行干预，激活VEGF-C/VEGFR-3通路。统计分析显示，经VEGF-C刺激后小鼠DAI明显下降，尤其在饲喂DSS诱导炎性反应加重后较DSS组下降显著，提示可缓解炎性反应。结肠组织病理学评分显示VEGF-C组较DSS组显著下降，但仍未达到正常水平，表明刺激VEGF-C/VEGFR-3通路可一定程度上缓解慢性结肠炎。LYVE-1免疫组织化学染色分析显示，3组小鼠的结肠组织间淋巴管密度未见明显差异，但VEGF-C组与DSS组淋巴管管径较正常组扩张明显，且VEGF-C组管径扩张更为显著。目前大量研究显示，促进淋巴管生成、增强淋巴管引流功能在控制慢性炎性反应方面具有巨大潜力，而IBD患者的结肠组织已表现为淋巴管数量增加、淋巴管阻塞、淋巴管炎，但结肠炎性反应未见缓解，提示单纯增加淋巴管数量对控制炎性反应的效果不佳，恢复、提升组织淋巴管引流功能才是促进炎症缓解的重点。本研究中VEGF-C组小鼠DAI及组织病理学评分提示炎症缓解，而结肠淋巴管数量未见明显增加，仅管腔扩张显著，由此可见，促进淋巴管扩张可增强淋巴管对炎症引流，缓解慢性结肠炎症。

综上所述，刺激VEGF-C/VEGFR-3通路主要通过刺激淋巴管进一步扩张、增加对炎症的引流来缓解慢性结肠炎症。VEGF-C在控制IBD病情进展方面具有重要的治疗意义。

参考文献

1 D′Alessio S, Correale C, Tacconi C, et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease[J]. J Clin Invest, 2014, 124: 3863-3878.

2 Jurisic G, Sundberg JP, Detmar M. Blockade of VEGF receptor-3 aggravates inflammatory bowel disease and lymphatic vessel enlargement[J]. Inflamm Bowel Dis, 2013, 19: 1983-1989.

3 Jurisic G, Sundberg JP, Bleich A, et al. Quantitative lymphatic vessel trait analysis suggests Vcam1 as candidate modifier gene of inflammatory bowel disease[J]. Genes Immun, 2010, 11: 219-231.

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5 Van Kruiningen HJ, Hayes AW, Colombel JF. Granulomas obstruct lymphatics in all layers of the intestine in Crohn′s disease[J]. APMIS, 2014, 122: 1125-1129.

6 Pedica F, Ligorio C, Tonelli P, et al. Lymphangiogenesis in Crohn′s disease: an immunohistochemical study using monoclonal antibody D2-40[J]. Virchows Arch, 2008, 452: 57-63.

7 Rahier JF, De Beauce S, Dubuquoy L, et al. Increased lymphatic vessel density and lymphangiogenesis in inflammatory bowel disease[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2011, 34: 533-543.

8 Kaipainen A, Korhonen J, Mustonen T, et al. Expression of the fmslike tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92: 3566-3570.

9 Tammela T, Saaristo A, Holopainen T, et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation[J]. Nat Med, 2007, 13: 1458-1466.

10 Zhou Q, Guo R, Wood R, et al. Vascular endothelial growth factor C attenuates joint damage in chronic inflammatory arthritis by accelerating local lymphatic drainage in mice[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63: 2318-2328.

11 Guo R, Zhou Q, Proulx ST, et al. Inhibition of lymphangiogenesis and lymphatic drainage via VEGFR-3 blockade increases the severity of inflammation in chronic inflammatory arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2009, 60: 2666-2676.

12 Huggenberger R, Ullmann S, Proulx ST, et al. Stimulation of lymphangiogenesis via VEGFR-3 inhibits chronic skin inflammation[J]. J Exp Med, 2010, 207: 2255-2269.

(本文编辑：周骏)

基金项目：国家自然基金青年基金(81200260)

通信作者：王晓蕾，Email: wangxiaolei@tongji.edu.cn

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.015

(收稿日期：2016-01-30)