骨髓间充质干细胞在溃疡性结肠炎小鼠模型结肠的定位

李荣富　高广周　孙　涛　王志红



·基础研究·

骨髓间充质干细胞在溃疡性结肠炎小鼠模型结肠的定位

李荣富高广周孙涛王志红

230032合肥市第二人民医院消化内科(李荣富，王志红)；100048北京，海军总医院消化内科(高广周，孙涛)

溃疡性结肠炎(UC)是一种病因和发病机制尚不清楚的慢性肠道炎性疾病，近年来UC的患病率呈明显升高趋势，有报道约为11.6/10万[1]，目前缺乏有效的治疗方法。1996年Tyndall等[2]用异体造血干细胞移植治疗白血病合并UC患者时，发现其对白血病起治疗作用的同时，也明显改善了UC的症状，这为UC的治疗方法研究提供了新的思路。目前干细胞移植用于UC的治疗是国内外相关领域研究的热点之一。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)在小鼠远端结肠的定位情况，为干细胞移植治疗UC的实验研究提供理论基础。

1材料与方法

1.1实验动物

健康BALB/c小鼠，雌性(8周龄)30只，雄性(3周龄)4只，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2007-004，饲养于海军总医院实验动物中心SPF级动物实验室。

1.2主要试剂及仪器

DMEM/F12培养基(Thermo)；PE标记小鼠抗人CD44、CD34、CD45、CD90抗体(Biolegend)；葡聚糖硫酸钠(MP Biomedicals)；兔抗SRY蛋白单抗(Sigma)；细胞培养箱(Thermo Forma)；倒置荧光显微镜(Nikon)。

1.3BMSC的分离培养及鉴定

脱臼处死雄性小鼠，无菌条件下分离胫骨及股骨，暴露骨髓腔，用培养液冲洗骨髓腔，收集后过滤离心，1000 r/min离心5 min，弃上清液后用培养液重悬细胞，37 ℃，5% CO2饱和湿度下培养。72 h首次换液，细胞繁殖长满瓶底90%时，按1∶2比例传代。细胞培养过程中逐日观察细胞贴壁特性及形态。并利用流式细胞仪检测P3代细胞CD34、CD44、CD45、CD90的表达情况。

1.4实验动物分组及UC模型的建立

30只雌性BALB/c小鼠随机分为2组，移植组[5%葡聚糖硫酸钠(DSS)+干细胞移植]20只，空白组10只。根据Kihara等[3]方法建立急性DSS小鼠UC模型，将DSS溶于蒸馏水，配成5%DSS溶液，让移植组小鼠自由饮用7 d，建立UC模型。

1.5小鼠疾病活动指数评分

造模期间每日观察造模小鼠的体质量变化、大便性状及便血情况，按表1[4]进行评分，得出每只小鼠的疾病活动指数(DAI)评分(表1)。

表1　DAI评分标准

注：正常成形大便；松散不黏附于肛门的糊状、半成形大便；稀便可黏附于肛门的稀水样便

1.6 BMSC移植及取材

造模后，移植组小鼠经鼠尾静脉回输P3代雄性小鼠BMSC，细胞数目和液体量为每只1×106/0.4 mL；空白组小鼠各经鼠尾静脉回输生理盐水0.4 mL。移植组及空白组于移植后0 d(BMSC移植前)、3 d、7 d、14 d、21 d分别处死4只及2只。小鼠麻醉后仰卧位固定，暴露腹腔组织，距肛门1 cm处取结肠组织2 cm，以10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，连续4 μm切片，共切3张，用于组织切片苏木精-伊红(HE)染色、性别决定区Y(SRY)蛋白免疫组织化学染色。

2结果

2.1BMSC培养结果

原代细胞培养12 h，可见细胞贴壁现象，72 h首次换液后，可见瓶底贴壁细胞散在生长，分布不均，部分呈集落状或单个细胞存在，胞体呈长梭形，两端有长突起，折光性差，核不清楚(见图1A)。原代培养 7 d，悬浮细胞已清除，贴壁细胞形态一致，培养瓶底部细胞达90%融合，呈漩涡状或辐射状排列，细胞形态狭长，核呈椭圆形，进行第1次传代培养(见图1B)。随着传代次数增加，细胞不断增殖分化形成均一的梭形细胞，梭形细胞呈放射状向周边生长，即呈典型的极性漩涡状(见图1C)。

图1　BMSC培养结果(×100)　A　原代3 d　B　原代7 d　C　P3代

2.2 BMSC表面抗原鉴定结果

经流式细胞术检测，经培养至第3代细胞的藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记CD34(Date.07)阳性率为0.61%、PE标记CD45(Date.04)阳性率为0.28%、PE标记CD44(Date.03)阳性率为99.42%、PE标记CD90(Date.02)阳性率为98.69%、空白对照组阳性率为0.45%(Date.01)(见图2)。

图2　CD34、CD44、CD45、CD90抗体流式细胞术检测结果

2.3造模期间小鼠DAI评分

空白组小鼠DAI评分在实验过程中为0；移植组小鼠饮用5%DSS后的第1天和第2天，DAI评分也均为0，第3、4、5、6、7 天的DAI评分依次为(1.06±0.96)、(2.48±1.23)、(4.32±1.43)、(7.26±1.62)、(8.92±1.01)，见图3。

图3　移植组小鼠DAI评分

2.4结肠组织HE染色结果

移植组饮用DSS 7 d后，结肠黏膜多处糜烂、溃疡、出血，黏膜上皮不完整，部分上皮细胞坏死脱落，黏膜层及黏膜下层广泛充血、水肿，炎性反应主要累及黏膜及黏膜下层，浸润的炎性细胞以中性粒细胞为主；空白组结肠黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、结构清楚，黏膜层及黏膜下层无异常(见图4)。

图4两组的结肠组织HE染色结果A空白组(×100)B移植组(BMSC移植前，×400)

2.5SRY蛋白免疫组织化学检测结果

结果显示，移植组的结肠组织在移植后3、7、14、21 d均可检测到SRY蛋白阳性细胞，部分阳性细胞呈簇排列(见图5)。

图5移植组的结肠组织中SRY蛋白阳性细胞检测结果(×100)A阳性对照BBMSC移植前C移植后3 dD移植后7 dE移植后14 dF移植后21 d

3讨论

3.1BMSC的分离及培养

BMSC是一种具有多向分化潜能的细胞，在特定的条件下能诱导分化形成多种非造血组织细胞(如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等)。目前对于BMSC的分离与培养，存在着流式细胞分选法、密度梯度离心法、免疫磁珠法及全骨髓贴壁筛选法等多种方式。全骨髓贴壁筛选法是最早也是较简单的提取分离方法，有研究表明扩增1代及2代后，BMSC的纯度分别达到95%和98%[5]。本实验采用的是全骨髓贴壁筛选法，获取的BMSC在培养12 h后即可贴壁，在培养7 d后培养瓶底即有90%融合，表明原代细胞生长旺盛，增殖能力强，可在体内快速大量增殖；传至P3代后BMSC形态单一均匀，呈典型的极性漩涡状生长，说明经全骨髓培养法所获取的BMSC纯度较高。

3.2BMSC的鉴定

BMSC没有理想的特异性表面标志物，它既有间质细胞的表面抗原，又有内皮细胞、上皮细胞及肌肉细胞的表面抗原，包括表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD120 a、CD124、CD166等表面抗原[6]，不表达的是造血细胞表面标志物，包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45等。目前实验中应用的BMSC的表面分子，只是相对接近于BMSC，比如首先排除造血前体细胞标志物抗原CD34，白细胞标志物抗原CD45，以及单核细胞、巨噬细胞表面抗原CD14 等；再检测BMSC表达阳性的细胞表面标志物，如CD13、CD29、CD44、CD90、CD105。由于没有特异性的表型，其鉴定尚无统一标准，这给准确鉴定BMSC带来一定的困难。本实验利用流式细胞术检测细胞表面CD45、CD34、CD44、CD90抗原的表达率，发现CD44和CD90表达率>98%，而CD45和CD34表达率<1%，符合BMSC表面抗原表达特征。

3.3UC模型的建立

从20世纪60年代至今，为研究UC，学者们制作了多种动物模型，如化学物质诱导模型、免疫致敏模型、细胞移植模型和基因敲除模型等[7]。其中化学物质诱导模型的准备方法较为简单、经济，且在许多方面与人类UC有相似之处。1985年日本学者首次应用DSS制备UC模型，此后大量研究表明DSS诱导的UC模型在临床表现、肠道病理和发病机制等方面均与人类UC相似[8]。本实验采用的是DSS诱导的UC模型，DAI评分随着饮用DSS时间的延长而升高，与UC急性期主要临床表现完全相符。饮用DSS 7 d后，远端结肠组织HE染色结果显示黏膜多处糜烂、溃疡、出血，黏膜层及黏膜下层充血水肿，炎性细胞浸润，与Okayasu等[9]的研究结果一致。结合制模小鼠临床病理表现，表明本研究成功复制了BALB/c小鼠急性UC模型。

3.4BMSC的示踪

有研究表明，BMSC具有向损伤组织趋化及低免疫原性的特性，可在造血组织以外的多种组织如肺、骨、软骨、皮肤等处定位和分布，移植后无免疫排斥反应[10-11]。为了追踪移植细胞，必须对细胞进行标记，目前细胞的标记方法主要有荧光染料标记法、抗原标记法、转基因标记法、Y 染色体标记法、磁性标记法等。Y 染色体标记法是将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内后，对Y染色体进行检测，此法不受时间和细胞表型变化的影响，也不受组织类型的限制[12-13]，其稳定性及特异性均较高，且可在受体体内终生存在，被认为是检测移植细胞的金标准。本实验采用的是Y染色体标记法，Y染色体为雄性个体所独有，所有被分析的哺乳动物的Y染色体上都能找到原始性别决定基因Sry。本研究通过免疫组织化学检测Y染色体上的Sry基因所表达的SRY蛋白，结果显示移植组的结肠组织在BMSC移植后3、7、14、21 d均可检测到SRY蛋白阳性细胞，表明移植细胞在炎性反应等因素的作用下向受损肠道迁移，并可在受损肠道定位成活，这为应用BMSC移植治疗UC提供了可能。然而，对于移植后定位于受损肠道的干细胞是否有功能、是否发挥了对肠道的修复作用以及通过何种途径发挥作用，尚需进一步研究。

参考文献

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3 Kihara N, de la Fuente SG, Fujino K, et al.Vanilloid receptor-1 containing primary sensory neurones mediate dextran sulphate sodium induced colitis in rats[J]. Gut, 2003, 52: 713-719.

4 Murano M, Maemura K, Hirata I, et al. Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B (p65) antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis[J]. Clin Exp Immunol, 2000, 120: 51-58.

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11 Azizi SA, Stokes D, Augelli BJ, et al. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-similarities to astrocyte grafts[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95: 3908-3913.

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(本文编辑：林磊)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.014

(收稿日期：2015-12-30)