牛黄酸对CCl4所致大鼠肝纤维化抑制作用的研究

李　静，杨雅娟，李常娟，冯　艳

(河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002)



牛黄酸对CCl4所致大鼠肝纤维化抑制作用的研究

李静，杨雅娟，李常娟，冯艳

(河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002)

[摘要]目的研究牛磺酸对CCl4所致大鼠肝纤维化的抑制作用。方法将120只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组及牛磺酸150，300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组，每组20只。除正常对照组外，其余组均采用CCl4复合法制备肝硬化门静脉高压大鼠模型。造模成功后，各给药组灌胃相应剂量药物，正常对照组、模型组灌胃等容积生理盐水，均每天1次，连续4周。灌胃结束后测定各组血清ALT、AST、TBil及肝纤维化四项(CⅣ、PCⅢ、LN、HA)水平， HE染色法观察各组大鼠肝脏组织病理形态学变化并对肝细胞坏死、纤维组织增生程度进行分级评分，测定肝组织中羟脯氨酸(HYP)、一氧化氮(NO)、环鸟苷酸(cGMP)含量及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。结果牛磺酸300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组血清ALT、AST、TBil、CⅣ、PCⅢ、HA水平均明显低于模型组(P均<0.05)，牛磺酸600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组LN水平均明显低于模型组(P均<0.05)；牛磺酸各组肝脏组织纤维化病变明显改善，其中以600 mg/kg组最为显著；牛磺酸300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组肝脏组织中HYP含量均明显低于模型组(P均<0.05)，NO含量明显高于模型组(P均<0.05)，牛磺酸600 mg/kg组eNOS活性和cGMP含量均明显高于模型组(P均<0.05)。结论牛磺酸对CCl4所致大鼠肝脏组织纤维化具有抑制作用，可能与其能够有效上调eNOS表达、提高NO和cGMP含量、保肝降酶以及改善肝功能有关。

[关键词]牛磺酸；CCl4；肝纤维化；复方鳖甲软肝片

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，但具有可逆性。因此，在肝纤维化阶段进行药物干预治疗，阻断其发生和发展或许是防治肝硬化的有效途径[1]，所以寻找能够有效抑制甚至逆转肝纤维化的药物具有非常重要的医学价值。牛磺酸是一种含硫β-氨基酸，为名贵中药牛黄的重要成分之一，具有促进胆汁排泄、改善肝硬化大鼠肝脏组织病变和细胞超微结构病变、抑制心肌组织纤维化等药理学作用[1-3]，但牛磺酸是否能够通过抑制肝组织纤维化而对肝硬化的发生发展起到防治作用尚少见报道。本实验通过CCl4复合法制备肝纤维化大鼠模型，探讨牛磺酸对CCl4所致肝纤维化的抑制作用，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1药物与试剂牛磺酸(美国Sigma公司，批号：140213，含量≥98%)；复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，批号：20140624)；ALT、AST、TBil测定试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；CⅣ、PCⅢ、LN、HA、羟脯氨酸(HYP)、一氧化氮(NO)、环鸟苷酸(cGMP)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)试剂盒均购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.2动物雄性SPF级SD大鼠120只，7周龄，体质量200～250 g，购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003，动物合格证号：201504016。

1.3方法

1.3.1动物分组、模型制备与给药将120只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组及牛磺酸150，300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组，每组20只。除正常对照组外，其余各组大鼠经皮下注射CCl4溶液(浓度40%，0.3 mL/100 g)，每3 d 1次，喂给高脂高胆固醇饲料，并饮用15%乙醇，6周后随机取模型组大鼠2只进行病理学检查，证实造模成功后，各给药组灌胃相应剂量药物，正常对照组、模型组灌胃等容积生理盐水，剂量为2 mL/kg，均每天1次，连续4周。

1.3.2血清ALT、AST、TBil及肝纤维化四项指标水平测定灌胃结束后，麻醉大鼠后开腹经腹主动脉取血，离心(1 500 r/min，10 min)取血清，然后按照试剂盒操作方法步骤通过生化检测仪测定各组大鼠血清ALT、AST、TBil水平，通过酶标仪平行测定各组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平。

1.3.3肝脏组织病理形态观察及半定量分析每组随机选取10只大鼠，取肝脏组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，依次行石蜡包埋、切片(厚度约5 μm)和展片处理，然后行常规HE染色，通过倒置光学显微镜观察各组大鼠肝脏组织病理形态结构。参照马玉珍等[4]报道的方法对肝细胞坏死、纤维组织增生程度进行分级和评分。肝细胞坏死：呈点灶状坏死、弥散分布()计3分，分布范围较广()计2分，散在分布(+)计1分，无变化为(-)计0分。肝纤维组织增生：胶原纤维呈宽条索状、增加明显，表现为分隔成假小叶()，计3分；胶原纤维呈细条索状、散在分布，表现为不完全假小叶()，计2分；胶原纤维含量增加，很少形成条索状，可见汇管区扩大，纤维化(+)，计1分；无变化为(-)，计0分。

1.3.4肝脏组织中HYP、NO、cGMP含量及eNOS活性测定取每组剩余的大鼠，麻醉后开腹取肝脏组织，剪碎后研磨匀浆，低温离心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)后取上清液。按照ELISA试剂盒操作方法、通过酶标仪平行测定各组大鼠肝脏组织中HYP含量，通过硝酸还原酶法测定NO含量，化学比色法测定eNOS活性，放射免疫法测定cGMP含量。

2结果

2.1各组大鼠血清ALT、AST、TBil水平比较模型组大鼠血清ALT、AST、TBil水平均明显高于正常对照组(P均<0.05)；牛磺酸300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组血清ALT、AST、TBil水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清ALT、AST、TBil水平比较

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平比较模型组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平均明显高于正常对照组(P均<0.05)；牛磺酸300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组血清CⅣ、PCⅢ、HA水平均明显低于模型组(P均<0.05)，牛磺酸600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组血清LN水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肝脏组织形态结构及肝细胞坏死、纤维组织增生程度比较正常对照组大鼠肝脏组织形态和细胞结构均未见异常，见图1；模型组大鼠肝脏组织呈纤维组织增生、纤维间隔形成、汇管区及中央静脉周围可见炎细胞浸润等明显的病理性改变，见图2；与模型组比较，各给药组大鼠肝脏组织病变呈不同程度改善，其中以牛磺酸600 mg/kg组改善效果最为显著，见图3～6。通过对肝细胞坏死和肝纤维组织增生程度进行分级评分发现：模型组肝细胞坏死和肝纤维组织增生程度显著高于正常对照组，牛磺酸300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组肝细胞坏死和肝纤维组织增生程度与模型组比较显著减轻(P均<0.05)，见表3。

图1　正常对照组大鼠肝脏组织形态结构表现(HE，×200)

图2　模型组大鼠肝脏组织形态结构表现(HE，×200)

图3　牛磺酸150 mg/kg组大鼠肝脏组织形态结构表现(HE，×200)

图4　牛磺酸300 mg/kg组大鼠肝脏组织形态结构表现(HE，×200)

图5　牛磺酸600 mg/kg组大鼠肝脏组织形态结构表现(HE，×200)

图6　复方鳖甲软肝片540 mg/kg组大鼠肝脏组织

2.4各组大鼠肝脏组织中HYP、NO、cGMP含量及eNOS活性比较模型组大鼠肝脏组织中HYP含量明显高于正常对照组(P<0.05)，NO、cGMP含量及eNOS活性均明显低于正常对照组(P均<0.05)；牛磺酸300，600 mg/kg组和复方鳖甲软肝片540 mg/kg组肝脏组织中HYP含量均明显低于模型组(P均<0.05)，NO含量明显高于模型组(P均<0.05)，牛磺酸600 mg/kg组eNOS活性和cGMP含量均明显高于模型组(P均<0.05)。见表4。

表3　各组大鼠肝细胞坏死、纤维组织增生程度比较±s)

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

3讨论

CCl4复合法诱导制备的肝纤维化大鼠模型具有与人类类似的肝硬化病理生理特征，多用于抗肝纤维化的药物治疗研究[5-6]。CⅣ、PCⅢ、LN、HA是临床上用来监测肝纤维化的常用指标；另外在肝纤维化发生发展过程中，胶原纤维大量增生，其主要成分为胶原蛋白，而HYP主要存在于胶原蛋白中，因此其含量也能够反映肝硬化程度[7]。牛磺酸是一种含硫β-氨基酸，具有抗氧化、保护心血管、抑制肝组织纤维化等多种生物学作用，本实验通过CCl4复合法制备肝纤维化大鼠模型进行研究发现，牛磺酸能够有效降低肝纤维化大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA、ALT、AST、TBil水平及肝组织中HYP含量，改善肝脏组织病理形态变化并抑制肝细胞坏死和肝纤维组织增生，上述作用均以牛磺酸高剂量组效果最为显著，提示牛磺酸对CCl4所致肝纤维化具有剂量依赖性的抑制作用。

表4　各组大鼠肝脏组织中HYP含量、NO含量、eNOS活性、cGMP含量

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

NO是一种信号分子，能够通过激活可溶性腺苷酸环化酶、升高细胞内cCMP水平而发挥刺激血管舒张，促进血液循环的生理作用[8]，而eNOS是体内催化NO生成的生物酶。本实验研究发现，牛磺酸能够有效促进肝纤维化大鼠肝脏组织中eNOS表达，提高NO及cGMP含量，提示牛磺酸能够通过调节NO信号传导通路而表现出降低肝内血管阻力的作用。

综上所述，牛磺酸对CCl4所致大鼠肝脏组织纤维化具有抑制作用，可能与其能够有效上调eNOS表达、提高NO和cGMP含量、保肝降酶以及改善肝功能有关。

[参考文献]

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[作者简介]李静，女，硕士，主治医师，主要从事消化内科疾病研究工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.005

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)23-2522-04

[收稿日期]2016-03-10

Inhibitory effects of Taurine on liver fibrosis induced by CCl4in rats

LI Jing, YANG Yajuan, LI Changjuan, FENG Yan

(The First Hospital of Handan, Handan 056002,Hebei,China)

Abstract:Objective It is to investigate the inhibitory effects of Taurine(Tau) on liver fibrosis induced by CCl4 in rats. Methods One hundred and twenty experimental rats were randomly divided into six groups: normal control group, model group, Tau(150, 300 and 600 mg/kg) groups and Fufangbiejiarangan tablet 540 mg/kg group,each group had 20 rats. The cirrhosis rat models were established by injecting CCl4.The drugs were given by intragastric administration for 4 weeks, once a day. The content of ALT, AST, TBil, CⅣ, PCⅢ, LN, HA in serum and the level of HYP in hepatic tissue were determined; the histopathological changes of the hepatic tissue was observed by HE staining and were semi-quantitative analyzed; the content of NO, cGMP and the activity of eNOS in hepatic tissue were determined. Results Compared with model control group, the contents of ALT, AST,TBil, CⅣ, PCⅢ, HA in serum and the HYP in hepatic tissue of Tau 300, 600 mg/kg groups were significantly decreased (P<0.05), and the content of LN in 600 mg/kg groups was significantly decreased(P<0.05); the hepatic tissue histopathological changes of Tau treated groups were significantly improved, especially in the Tau 600 mg/kg group the improvements were more significant; the content of NO in hepatic tissue of Tau 300, 600 mg/kg groups were significantly increased(P<0.05), the eNOS expression of Tau 600 mg/kg treated group was significantly increased (P<0.05) and the content of cGMP was significantly decreased (P<0.05). Conclusion Tau had inhibitory effects on liver fibrosis induced by CCl4 in rats, which perhaps related to its effects on upregulating eNOS expression, enhancing the content of NO and cGMP, enzyme activity inhibition and hepatic tissue protection, improving liver function.

Key words:Taurine; CCl4; liver fibrosis; protecting effect