牛奶乳清液对小鼠学习记忆能力的影响

刘永峰， 赵晓微， 刘满顺， 李蕊蕊

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院, 陕西 西安 710119)



牛奶乳清液对小鼠学习记忆能力的影响

刘永峰*， 赵晓微， 刘满顺， 李蕊蕊

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院, 陕西 西安 710119)

以昆明小鼠为研究对象，应用小鼠Y型迷宫实验的方法，以环磷酸腺苷(cAMP)为阳性对照，以达标所需训练次数/天数(TN/TD)、正确反应率(CRR)、全天总反应时间(TRT)、主动回避率(AAR)为评价指标，开展不同浓度牛奶乳清液对小鼠学习记忆能力影响的研究。结果表明:阳性对照较空白对照组可显著降低小鼠TN(P<0.05)，灌胃半个月后可显著降低小鼠TRT并显著提高AAR(P<0.05)，并且灌胃一个月以后对小鼠CRR有明显升高作用(P<0.05)；牛奶乳清液较空白对照组可显著降低小鼠TN/TD(P<0.05)，灌胃半个多月后可显著升高小鼠的CRR和AAR，显著降低小鼠TRT(P<0.05)；与阳性对照组相比较，牛奶乳清液对小鼠CRR影响不显著(P>0.05)，但可显著降低小鼠TN/TD，显著升高AAR(P<0.05)，对于灌胃2个月小鼠的TRT降低效果更好，而且均以3/4倍稀释的牛奶乳清液效果最佳。因此，牛奶乳清液具有一定促进小鼠学习记忆能力的作用。

乳清液； 学习记忆能力； 小鼠Y型迷宫；环磷酸腺苷

学习是神经系统接受环境变化而获得新行为的过程，记忆是学习后经验的储存和保持，学习和记忆是脑的重要功能。学习记忆的动物模型基本包括两个：一是防御性回避学习，包括梭箱、爬杆、电击等；二是辨别性学习，包括各类迷宫[1]。复杂迷宫已广泛应用于小鼠学习记忆能力测试以及相应药物的筛选和研究[2-3]。Y型迷宫具有操作简便、应用范围广、普通实验室应用方便等优点，同时可减少对仪器损坏和小鼠注意力干扰[4]。

牛奶中具有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质等营养素，还具有许多天然活性功能成分。牛奶及其乳清液中的这些营养功能成分已被应用，为牛奶综合利用提供了新思路[5-6]。其中，环磷酸腺苷(cyclic adenosine-3′,5′-monophosphate，cAMP)为牛奶生物活性物质中的重要成分，主要溶在乳清液中[7-8]。研究发现,cAMP作为细胞信息传递与调控的“第二信使”小分子，是记忆形成过程所必需的一种关键分子，可通过促进神经元的存活、再生，引起突触可塑性变化[9]。cAMP介导的信号转导通路可启动cAMP反应单元结合蛋白的磷酸化并使其活化[10]，从而发挥其影响学习记忆能力等生物学功能[11]。但是，关于牛奶乳清液对动物及人类学习记忆能力的相关研究鲜有报道。因此，本研究采用小鼠Y型迷宫行为实验法，以cAMP作为阳性对照，研究牛奶乳清液对小鼠学习记忆能力的影响，以期为开发提高学习记忆能力的功能性乳制品提供理论参考。

1　材料与方法

1.1实验动物与材料

1.1.1实验动物 选用健康雄性的普通昆明小鼠20只，体重20～25 g，购置于西安交通大学动物实验中心。动物饲料为基础饲料，购置于西安交通大学动物实验中心。

1.1.2实验试剂cAMP标准品，德国Sigma公司，纯度99%以上；鲜牛奶，购于陕西省西安市郊农户家中，于4 ℃保存。

1.1.3实验仪器 高效液相色谱仪，美国Waters 公司；色谱柱 HC-C18(5 μm，4.6 mm×50 mm)，美国Agilent 公司；TU-2000 型紫外可见分光光度计，日本日立公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；D5-RZ 型离心机，湖南湘仪集团；Y型迷宫由等长的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂和三者的交界区组成，箱底铺设直径0.2 cm、长14 cm、间距1 cm的电栅，臂的内壁均贴有可导电的薄层铜片，每臂长45 cm，顶端各装一盏15 W的刺激信号灯。

1.2实验方法

1.2.1奶酪副产物乳清液的获得根据实验室多次摸索获得的奶酪制备工艺：鲜牛奶→纱布过滤→杀菌→冷却(至32 ℃)→添加MA菌种→发酵40 min→添加凝乳酶、氯化钙→凝乳(32 ℃，2 h)→凝乳切割→排乳清(40 ℃)→一次压榨(1 h)→二次压榨(12 h)→奶酪。收集该工艺中制作奶酪剩余的液体后，通过75 ℃加热和5 000 r/min离心10 min去除液体中上浮的乳脂肪和下部沉淀，取中间清液；再通过逐渐冷却，4 ℃低温静置12 h，结晶乳糖，取上清液5 000 r/min离心5 min，取上清液，得到处理后的乳清液，备用。

1.2.2实验小鼠筛选与分组将小鼠放入Y型迷宫箱中进行筛选实验，小鼠适应3～5 min后，给予40～60 V脉冲电击。选择活跃、对电击反应敏感、逃避反应迅速的小鼠供测试用，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的小鼠。最终，将筛选出的15只小鼠按随机区组实验设计方法随机分为5组，每组3只。

1.2.3小鼠分组处理与灌胃、训练方法按照不同处理方式分为空白对照组、阳性对照组、高浓度乳清液组、中浓度乳清液组、低浓度乳清液组5个实验组，每组进行cAMP的适应性灌胃实验10 d，分别每天灌胃蒸馏水1 mL、100 μg/mL的cAMP标准品水溶液1 mL、上述乳清液1 mL、稀释3/4倍的乳清液1 mL、稀释1倍的乳清液1 mL。所有小鼠每天上午9点左右灌胃相应的实验液体1 mL，观察无异常后进行Y型迷宫训练实验。各实验组小鼠饲喂饲料和饮水方法相同，均正常摄食饮水。

预实验结束后，进行4 d的小鼠Y型迷宫训练实验。小鼠训练实验采用固定次数随机休息法[12]，待所有小鼠训练达标后，统计各实验组小鼠达标所需训练次数。

此后，开展小鼠学习记忆能力的测试实验，开始记录小鼠实验天数，分别统计各实验组小鼠的正确反应率、全天总反应时间、主动回避率、记忆保持能力等指标。开展小鼠训练实验及学习记忆能力实验期间，所有实验小鼠的灌胃、摄食、饮水的方法和剂量均与预实验方法相同。

1.2.4小鼠Y型迷宫实验法本研究选择小鼠Y型迷宫实验方法[13]。训练时，进行小鼠的被动回避反应实验，即电击小鼠，逃离起步区后可能跑向非安全区，并在电击作用下最终才跑至安全区；训练初期，进行小鼠主动回避反应实验，即未形成记忆的小鼠会出现错误反应，但多次训练后，安全区灯亮，电刺激尚未开始时，小鼠立即逃往安全区。小鼠受电击后从起步区直接逃到安全区判定为“正确反应”，若逃到无灯光的任何另一臂，则判定为“错误反应”；小鼠连续10次中有9次或以上为“正确反应”时，判定为“学会”标准。

1.2.5小鼠Y型迷宫实验法的衡量指标本研究选择王跃春等[14]报道的指标，这些指标可综合反映小鼠的记忆力保持能力。具体指标如下：

(1)训练次数/天数(training numbers/days, TN/TD)：TN是小鼠学习达到“学会”标准前所需的测试次数，表示其空间分辨反应的学习记忆成绩。所需次数越少说明学习速度越快或学习能力越强；所需次数增多，提示学习记忆能力下降。TD是记录小鼠达到“学会”标准所用的天数。所需的天数越多表示达到“学会”标准所需时间越长，则学习记忆成绩下降。

(2)正确反应率(correct response rate, CRR)：CRR反映小鼠反应的正确程度。根据下式，计算出每个实验组小鼠的CRR：

CRR(%)=a/b×100%,

式中：a为小鼠完成所有反应中正确反应的次数；b为小鼠在一次实验中完成的总反应次数。

(3)全天总反应时间(total reaction time, TRT)：TRT指从信号灯亮开始至小鼠第1次逃至安全区所耗的秒数，是一个实验日完成所有反应(包括正确反应和错误反应)所需时间。

(4)主动回避率 (active avoidance rate, AAR)：根据下式，计算出每个实验组小鼠的AAR：

AAR(%)=c/d×100%,

式中：c为小鼠在灯亮后但未通电的5 s内完成逃避反应的次数；d为小鼠在一次实验中完成的总反应次数。

1.2.6统计分析方法所有实验结果，采用DPS软件分析，结果用平均数±标准差表示。

2　结果与分析

2.1不同浓度乳清液对小鼠TN/TD的影响

通过小鼠Y型迷宫实验，不同实验组TN/TD的影响结果，如表1所示。从表1可知，与空白对照组相比，阳性对照组小鼠TN显著减少(P<0.05)，TD无显著差异(P>0.05)，说明cAMP标准品对于减少小鼠训练次数有明显作用，可以增强小鼠学习能力。3个浓度乳清液组小鼠TN/TD均较空白对照组有显著差异(P<0.05)，且以中、低浓度乳清液组的效果为最好(P<0.05)，说明牛奶乳清液，尤其是中、低浓度乳清液可以明显减少小鼠训练次数和时间，加快小鼠学习速度，增强小鼠学习能力。此外，3个浓度乳清液组TN/TD值较阳性对照组均显著降低(P<0.05)，说明在Y型迷宫学习训练初期，不同浓度的乳清液对小鼠学习记忆能力的提高作用优于cAMP标准品。

表1　不同浓度乳清对小鼠TN/TD的影响

注：同一列中不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。

2.2不同浓度乳清液对小鼠CRR的影响

通过小鼠Y型迷宫实验，不同实验组CRR的影响结果如图1所示。从图1可知，随着时间的增加，空白对照组小鼠的CRR呈现先下降后略微上升的趋势，各乳清液组小鼠的CRR上下波动不大，说明随着时间的增加小鼠的记忆力开始下降，而乳清液对小鼠的记忆力保持有一定的作用。实验第1天和第6天各组小鼠的CRR无显著差异(P>0.05)，说明可能是小鼠接受4 d迷宫训练后开展实验，有一定的持续训练记忆能力。第13天，三个浓度乳清液组小鼠的CRR显著高于空白对照组(P<0.05)，且以中浓度组为最好，阳性对照组和各乳清液组之间差异显著(P<0.05)；第28天，阳性对照组和各乳清液组小鼠的CRR均较空白对照组显著升高(P<0.05)，且阳性对照组和各乳清液组之间差异不显著(P>0.05)；第58天，阳性对照组和各乳清液组小鼠的CRR显著高于空白对照组(P<0.05)，且阳性对照组和各乳清液组之间差异不显著(P>0.05)。说明在实验后期，乳清液对小鼠的学习记忆力有明显的影响。在第13天的实验中，三个浓度乳清液组小鼠CRR明显高于阳性对照组，后期基本没有差异，说明牛奶乳清液对于小鼠记忆保持力的影响要早于cAMP标准品。

图1不同浓度乳清液对小鼠CRR的影响

Fig.1Effects of different concentrations of whey liquid on CRR values of mice

注：不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。

2.3不同浓度乳清液对小鼠TRT的影响

不同实验组小鼠的TRT影响结果如图2所示。从图2可知，实验第1天，中、低浓度乳清液组小鼠的TRT与空白对照组差异显著(P<0.05)，而阳性对照组和高浓度乳清液组小鼠的TRT与空白对照组差异不显著(P>0.05)；第6天和第13天，阳性对照组以及中、低浓度乳清液组小鼠的TRT与空白对照组差异显著(P<0.05)；第28天，阳性对照组和三种浓度乳清液组小鼠的TRT均较空白对照组显著降低(P<0.05)，且以中浓度乳清液组为最好；第58天，阳性对照组和三种浓度乳清液组小鼠的TRT均较空白对照组显著降低(P<0.05)，且以中浓度乳清液组为最好。说明cAMP标准品和乳清液都可以对小鼠的学习记忆力产生一定影响，尤其是中浓度乳清液的效果最好。此外，不同浓度乳清液组与阳性对照组比较，中浓度乳清液组的小鼠TRT显著低于阳性对照组(P<0.05)，说明适量的乳清液对小鼠学习记忆能力的提高作用优于cAMP标准品。

图2不同浓度乳清液对小鼠TRT的影响

Fig.2Effects of different concentrations of whey liquid on TRT values of mice

注：不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。

2.4不同浓度乳清液对小鼠AAR的影响

不同实验组小鼠AAR的结果如图3所示。从图3可知，实验第1天，与空白对照组相比，仅有中、高浓度乳清液组的小鼠有显著的主动规避行为(P<0.05)；但第6天的阳性对照组及各浓度乳清液组小鼠AAR均较空白对照组有显著差异(P<0.05)，且以中浓度乳清液组为最好；第13天，阳性对照组及各浓度乳清液组的AAR均较空白对照组有显著差异(P<0.05)，且以中、低浓度乳清液组的小鼠为最好；第28天，阳性对照组及各浓度乳清液组小鼠AAR均较空白对照组有显著差异(P<0.05)，且以中浓度乳清液组为最好；第58天，阳性对照组及各浓度乳清液组小鼠AAR显著高于空白对照组(P<0.05)，且以中浓度乳清液组为最好。说明小鼠学习训练1～6 d后，cAMP标准品及牛奶乳清液对小鼠的学习记忆力有明显的影响；且适量浓度乳清液对小鼠学习记忆力的提高作用优于cAMP标准品。

图3不同浓度乳清对小鼠AAR的影响

Fig.3Effects of different concentrations of whey liquid on AAR values of mice

注：不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。

3　讨论

Y型迷宫是20世纪60年代开始使用的一种研究啮齿类动物的常见行为学手段[15-16]。它是根据啮齿类动物喜阴暗的天性，给以电刺激迫使其逃离阴暗区、趋向光亮区，从而建立与其本能相反的一种行为方式，可用于测试动物的工作记忆，研究大脑的记忆功能[17]。因此，本研究采用Y型迷宫测定小鼠学习记忆能力具有重要的指导意义。

cAMP在学习和记忆过程中发挥着十分重要的作用，引起了国内外学者的广泛关注。江刚等[18]研究发现，大鼠进行Y型迷宫厌暗学习时，脑纹状体边缘区内的cAMP形成结合蛋白参与学习记忆的信号转导过程。谢敏等[19]研究表明，长期的游泳训练对大鼠脑内cAMP含量具有明显影响，特别是运动大鼠海马区cAMP含量较未运动大鼠存在极显著差异；揭示了在大鼠运动锻炼中，cAMP对于提高其学习记忆能力有重要作用，运动锻炼可能通过cAMP的作用巩固了小鼠记忆后期的学习记忆能力。本研究结果表明，cAMP标准品对于小鼠的TN有显著降低作用，对小鼠的TRT也有明显降低作用，对小鼠AAR有明显升高作用，对小鼠的CRR在灌胃一个月以后有明显升高作用。总体来说，cAMP对提高小鼠的学习记忆能力有一定的作用，与上述研究结果一致。此外，研究报道cAMP依赖蛋白激酶A(PKA)对于长时间突触可塑性和长时记忆具有重要作用，其活性受到cAMP的调控[20]；Nazi等[21]研究表明，细胞内cAMP浓度的适当增加可激活PKA，而cAMP的过量和减少都会造成学习记忆能力下降。然而本研究结果也有同样的发现，只有适量cAMP(中浓度乳清液)最有利于提高小鼠学习记忆能力。

奶酪副产物乳清液中的cAMP是天然型cAMP，具有cAMP的活性作用。本研究发现灌胃牛奶乳清液的小鼠在Y型迷宫测试中TN/TD明显降低，小鼠CRR在半个多月灌胃后明显升高，TRT明显降低，ARR明显提高。因此，牛奶乳清液和cAMP标准品一样，对小鼠学习记忆力也具有一定的提高作用。然而，牛奶乳清液与100 μg/mL的cAMP标准品相比较，牛奶乳清液对于小鼠的TN/TD降低作用更明显，对小鼠ARR升高作用也更明显，对于灌胃2个月小鼠的TRT降低效果更好；而且这些效果均以稀释至3/4倍乳清液的效果最佳。因此，适宜浓度的牛奶乳清液比cAMP标准品溶液更能促进小鼠的学习记忆能力。形成这一结果的原因可能是因为乳清液中除含有cAMP外，还含有微量的环磷酸鸟苷(cyclic guanosine 3′, 5′-monophosphate, cGMP)等成分[8]。乳清液中还含有牛磺酸、锌等的功能成分对改善小鼠学习记忆能力也起到一定作用。Idrissi[22]研究表明牛磺酸可促进神经系统的发育及细胞的增殖分化。郭燕[23]研究发现牛磺酸能改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力，并推测可能与牛磺酸改善胆碱能系统功能及对受损海马组织的修复有关。锌离子对学习记忆功能、神经的形成具有积极作用[24]，膳食锌摄入不足对海马区产生影响，可能引发一系列学习记忆相关功能的缺失[25]。此外，本研究发现，在小鼠学习记忆能力实验前期，灌胃牛奶乳清液的小鼠较灌胃cAMP标准品溶液小鼠形成了更好的学习记忆能力。据报道，cGMP与cAMP分别参与了记忆的早期形成以及记忆的后期巩固过程[26]；cGMP 在长时记忆早期的形成阶段其作用更明显，在目标认知实验训练后即刻注射cGMP溴化物能提高大鼠的实验成绩[27]；大鼠被动回避实验中，其海马区cGMP 水平在训练后即刻达峰值，相反cAMP 水平在3 h后才达到峰值[28]。可见，牛奶乳清液中cGMP可与cAMP起协同作用，共同促进小鼠的学习记忆能力，其作用效果比单纯运用较高浓度的cAMP标准品溶液更好，具体原因有待深入研究。

4　结论

本研究利用小鼠Y型迷宫实验，通过对小鼠灌胃蒸馏水、cAMP标准品溶液及不同浓度牛奶乳清液，测定TN/TD、TRT、AAR、CRR等学习记忆能力指标，研究发现cAMP在一定程度上可以提高小鼠的学习记忆能力，牛奶乳清液也具有促进小鼠学习记忆能力的作用，且适宜浓度的乳清液改善小鼠学习记忆能力的效果优于cAMP标准品溶液。cAMP作为一种功能物质在改善和提高记忆力方面有着巨大的应用前景，尤其是含有cAMP的牛奶乳清液有改善小鼠学习记忆能力新型作用的发现，对于牛奶的综合开发利用提供了坚实的理论基础。

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〔责任编辑宋轶文〕

Effect of whey liquid from milk on learning and memory ability of mice

LIU Yongfeng*, ZHAO Xiaowei, LIU Manshun, LI Ruirui

(School of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University,Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Kunming mice was used as the object to carry out the mice Y-maze experiments. The cyclic adenosine monophosphate(cAMP) was regarded as positive control, the training numbers/days (TN/TD), correct response rate (CRR), total reaction time(TRT) and active avoidance rate (AAR) was studied to evaluate the influence of different concentrations of whey liquid on learning and memory ability of mice. Compared the positive control with the blank one, the TN was significantly reduced (P<0.05) by the positive treatment. Besides, the mice were feed with cAMP after a half month (P<0.05), the TRT was notably dropped while the AAR was significantly improved; the CCR was markedly elevated(P<0.05)after a month treated. Furthermore, compared whey liquid treatment group with the blank control, TN/TD was significantly decreased in mice treated by whey liquid of milk , a observably improvement was found in CCR and AAR but the TRT was obviously decreased by the liquid after a half month(P<0.05). Whey liquid of milk have no effect on CCR(P>0.05)but have a significantly influence on the TN/TD reduction and AAR improvement(P<0.05)after 2 months treatment, and mice TRT reducing is better than other times. Whey liquid, particularly the liquid was 0.75 times diluted, have an significant effect on learning and memory ability of mice. Thus, whey liquid of milk has the effect on promoting learning and memory ability of mice.

whey liquid; learning and memory ability; mouse Y-maze; cAMP

1672-4291(2016)04-0108-06

10.15983/j.cnki.jsnu.2016.03.146

2016-01-04

陕西省青年科技新星项目(2014KJXX-51); 中国博士后科学基金(2015M570811); 中央高校基本科研业务费专项资金(GK201502008)

刘永峰,男,副教授,博士。E-mail:yongfeng200@126.com

TS252.1

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